Information

Hvorfor har min gel så dårlig opløsning?

Hvorfor har min gel så dårlig opløsning?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Splinterny bruger til bio denne side her. Jeg kørte denne gel (0,9% agarose, løb startende ved 60V derefter til 105V over ~30-45 minutter) med DNA-prøver indeholdende 20uL DNA og 1X sporingsfarve i hver af brøndene. Jeg ved ikke, hvorfor opløsningen af ​​denne gel er så dårlig. Jeg antager, at det er fra DNAse-aktivitet, da dette er, hvad min laboratorietekniker sagde, at det sandsynligvis var. Jeg er ret sikker på, at jeg gjorde alt rigtigt med hensyn til proceduren. Jeg er ikke sikker på, hvilken anden information jeg kunne give, bortset fra at prøverne blev forberedt og opbevaret ved -20C en uge før gelen blev kørt. Her er et billede af gelen nedenfor.


Selvom din teknik refererer til dine DNA-prøver, indikerer din stige også, at der er plads til forbedring af din løbeteknik. -20C i en uge burde ikke have påvirket kvaliteten af ​​DNA'et, forudsat at det var af god kvalitet, der gik i fryseren. Du kan mindske DNAase-aktiviteten ved at tilføje EDTA til din opbevaringsbuffer, som vil trække metalioner ud af opløsningen. Bare sørg for at tage det i betragtning, hvis du laver en reaktion senere, der kræver metalioner (som PCR).

DNA

Fokus først på DNA-prøverne. Der er et par ting at tjekke.

Hvor meget læssede du? Jeg kan se, du angav 20uL, men hvad var koncentrationen? Det er vigtigere at kende mængden af ​​ng, der bruges som prøve. Forskellige pletter har forskellige koncentrationer, de kan detektere (EtBr, SYBR, osv.) Jeg ville tjekke detaljerne for den farve, du bruger, for at sikre, at du indlæser en passende mængde DNA.

Er disse PCR-produkter? Hvis ja, hvor mange cyklusser blev din PCR kørt? Jeg har set lignende resultater fra PCR, hvis prøverne køres i for mange cyklusser. Ikke-specifikke produkter begynder at blive produceret i senere cyklusser og vil forårsage nedbrydning af dine specifikke produkter. Jeg ville også tjekke dine primere igen, forlængelsestiden og den polymerase, du bruger. Det er sværere at lave udvidelser af de 5,8 kb og 6,8 kb størrelser, du nævnte, men ikke umuligt.

Er disse restriktionsfordøjelser? Har du en kontrolbrønd, der viser det ufordøjede plasmid eller en anden kilde? Din kilde bør først have et rent bånd for at forvente et rent bånd i resultaterne. Hvis din kilde er ren og lys, og fordøjelsen ser ud som prøverne ovenfor, skal du kontrollere din fordøjelsesbuffer og enzymer.

Elektroforese

Der er flere ting, der kan forbedre kvaliteten af ​​en agarosegel. Thermofisher giver en guide til deres tips og tricks. Nedenfor er ting, som jeg har fundet nyttige i min egen erfaring.

  1. Tiden mellem støbning af gelen og kørsel af den. En almindelig praksis er at lave geler og opbevare dem i TBE/TAE-buffer, indtil de er klar til at blive brugt. Efter min erfaring vil kvaliteten af ​​gelen forringes over tid, hvilket giver diffuse bånd. De bedste resultater opnås med en friskhældt og støbt gel.

  2. Indlæsningsteknik. Forsigtigt at fylde prøverne i brøndene, så de sætter sig så tæt på bunden uden at blandes med den omgivende buffer er nøglen. De bedste resultater opnås ved at lade din pipettespids røre ved bunden af ​​brønden og langsomt trække den ud, mens du frigiver din prøve, så prøven ikke behøver at sætte sig ned i brønden af ​​sig selv.

  3. Kør umiddelbart efter indlæsning, og billede umiddelbart efter kørsel. Diffusion vil få pæne stramme bånd til at blive dårlige, jo længere prøverne sidder i brønden.

  4. Spænding, timing og agarosekoncentration. At få disse rigtige kræver øvelse. Du vil prøve at køre din gel så hurtigt som muligt. Jo længere tid det sidder i gelen, jo mere diffusion vil der forekomme. Hav dog spændingen for høj, og du risikerer at smelte din gel. Varier koncentrationen af ​​agarose for at målrette den størrelse af DNA, du leder efter. Jeg har tidligere brugt alt mellem 0,5% og 1,5%.

  5. Forfarvning af gelen eller efterfarvning? Jeg foretrækker forfarvning for de pletter, der fungerer godt, da det reducerer den tid, prøverne vil sidde i gelen, så der kan ske diffusion.

  6. Jeg kigger på din stige og linket til den medfølgende standard, og det er svært at sige, hvilke bånd der er hvilke. 3,0 kb-fragmentet skal skille sig ud som det lyseste, men det nederste bånd i din gel er det lyseste. Er dette 3.0kb-båndet? Måske. Det er svært at tælle antallet af bånd over det for at bekræfte. Hvis det ikke er tilfældet, hvilket kan indikeres af det faktum, at ingen af ​​dine prøver ser ud til at være løbet til slutningen af ​​gelen, så ville dette være 0,5 kb-båndet. Hvis det er 0,5 kb-båndet, svarer stigens intensitet ikke til din forventede intensitet. Dobbelttjek din stige, så du kan vide, hvilke størrelser du kigger på.


Slørede bånd. - (07/07/2012)

Hej,
Jeg har kørt SDS Pages i et stykke tid. for nylig lavede jeg nogle DNA-affinitetskromatografi-eksperimenter og kørte elueringerne på en 16% gel. Min særlige interesse er identifikation af mindre proteiner (omkring 10 - 20 kDa). Jeg ved ikke hvorfor, men tilsyneladende fremstår de mindre proteiner på min gel som slørede bånd (se vedhæftede fil), hvilket giver virkelig problemer for yderligere MALDI-analyse.

Er der nogen der ved hvordan jeg kan komprimere de nederste bånd? Ville det give mening at køre en 10% gel og bare stoppe løbet tidligere? Hvorfor sker dette egentlig?

Tak på forhånd,
Skål, Daniel
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4036" target="_blank">

Jeg ville tjekke saltindholdet i elueringsbufferen. Du kan prøve at dialysere mod en lavere saltbuffer for at få saltet lidt ned.

Hej,
ja .. Jeg tænkte på dette spørgsmål allerede før . sagen er, at med en DNA-affinitetskromatografi skal du øge saltkoncentrationen i elueringsbufferen. dialyse ville være en mulighed .. men ville foretrække en nemmere måde .

som for det vedhæftede billede (fra venstre mod højre) fra 100 mM NaCl til 1 M NaCl.
Som du kan se, er de bånd, jeg er interesseret i, fra 100 mM til 500 mM NaCl (med det stærkeste bånd omkring 350, 500 mM) .. faktisk gik jeg ud fra, at disse saltkoncentrationer ikke ville forstyrre kørslen.

. vil du have nogle forslag til hvordan man koncentrerer elueringen? Hvordan ville du i en vis forstand lave en dialyse, når du kun har omkring 40-50 ul eluering.

Jeg foreslår, at du måske skal undersøge din buffers spænding og temperatur, især efter en logkørsel. Måske skal du måske også ændre ved at bruge ny APS og B-mercaptoethanol. Jeg plejede at have slørede bånd, når sådanne ting ikke var rigtige.

Adrian K den 8. jul 05:24:08 2012 sagde:

Jeg foreslår, at du måske skal undersøge din buffers spænding og temperatur, især efter en logkørsel. Måske skal du måske også ændre ved at bruge ny APS og B-mercaptoethanol. Jeg plejede at have slørede bånd, når sådanne ting ikke var rigtige.

Jeg kan godt lide at bruge 3kDa amicon-filtre, når jeg kører serumprøver, de ville sandsynligvis fungere godt med din applikation. Jeg har brugt disse filtre på prøver alt fra 50 uL til 400 uL.

Jeg kan heller ikke rigtig se det ud fra det billede, du postede, men bruger du en stable gel? Det kan helt sikkert være med til at øge opløsningen.

proteaMatt den 9. jul 12:41:36 2012 sagde:

Jeg kan godt lide at bruge 3kDa amicon-filtre, når jeg kører serumprøver, de ville sandsynligvis fungere godt med din applikation. Jeg har brugt disse filtre på prøver alt fra 50 uL til 400 uL.

Jeg kan heller ikke rigtig se det ud fra det billede, du postede, men bruger du en stable gel? Det kan helt sikkert være med til at øge opløsningen.

Hej, tak for dit svar! Ideen med filteret lyder godt .. håber ikke de er for dyre. . Og ja, jeg har en stablingsgel, men skar den væk, før jeg begyndte med farvningen.

du kan afsalte ved dropdialyse

opløsning af proteiner og peptider med lav molekylvægt er ofte dårlig, selv med en høj akrylamidprocent, med tris-glycin-sds-geler. du kan få enestående opløsning af dine proteiner af interesse med en 10% tris-tricin-sds gel (shagger og von jagow).

mdfenko den 9. jul 16:30:18 2012 sagde:

du kan afsalte ved dropdialyse

opløsning af proteiner og peptider med lav molekylvægt er ofte dårlig, selv med en høj akrylamidprocent, med tris-glycin-sds-geler. du kan få enestående opløsning af dine proteiner af interesse med en 10% tris-tricin-sds gel (shagger og von jagow).

Hej, tak for dit svar .. Jeg vil måske give dette et skud i morgen .. er der nogen chance for, at du har en protokol tilgængelig til at forberede gelen såvel som bufferen? Kan jeg køre disse geler med et hvilket som helst system? Siden jeg fandt denne udtalelse:

Tris-Tricine-SDS (TTS) løbebuffer er katode (øvre reservoir) buffer

Jeg er lidt forvirret .. hvad betyder det med det øverste reservoir? Skal jeg bruge et specielt system til det .. skal jeg også bruge en anodebuffer?

EDIT: Så jeg gætter på, at det øverste reservoir er den del af samlingen mellem glaspladerne, og det nederste reservoir er hele tanken?


Mikroskoper forstørrer og viser flere detaljer

Når vi taler om, hvordan mikroskoper fungerer, siger vi ofte, at de får tingene til at se større ud – det vil sige, at de forstørrer dem. Vi beskriver det, vi ser nede i mikroskopet, på samme måde, for eksempel kan vi sige, at den døde flue, vi ser på, er blevet forstørret 200 gange. Dette hjælper os til at forstå, hvad vi ser. Det hjælper også andre, der ser på vores fotografier eller tegninger, til at forstå, hvad de ser på. Det er grunden til, at alle mikrofotografier offentliggjort i videnskabelige tidsskrifter skal angive omfanget af forstørrelsen.

Men at gøre tingene større er kun en del af historien. Hvis mikroskoper ikke gjorde andet end at gøre det, vi allerede kan se, større, ville de ikke være til stor nytte! I stedet øger mikroskoper mængden af ​​detaljer, som vi kan se. Et andet ord for detaljeringsgraden, vi kan se, er 'opløsning'

For at forstå forskellen mellem at forstørre noget og øge de detaljer, der er synlige, skal du se på dette digitale foto af harakeke.


PCR-produkt: klon eller direkte sekvens?

7-8 kloner for at sikre indfangning af denne information med klonet produkt med direkte sekventering, vil en sådan heterozygositet sædvanligvis være synlig som to overlappende toppe, der er omtrent ½ så høje som omgivende toppe. Ikke desto mindre kan data nogle gange ikke opnås uden kloning. Se "Anden information 'guldminer' på denne hjemmeside? for yderligere information.

en) Enkelt-produkt: Prøv direkte sekventering af oprenset PCR-produkt (ved kommercielle kolonner, standard ethanolpræcipitation eller ExoSap), når prøven kører som et rent, enkelt bånd i en agarosegel (typisk 0,8 - 3,0 %, afhængig af fragmentstørrelse).

b) Flere bands: Prøv direkte sekventering af gel-oprenset PCR-produkt, når prøven kører som et rent bånd blandt andre bånd i en agarosegel.

c) 'Enkeltbase'-regioner: Hvis du ved, at din sekvens indeholder en ren poly-'singlebase'-region (>8-10 baser), skal du enten klone produktet eller prøve direkte sekventering i begge retninger. (På grund af strengglidning under den oprindelige PCR bliver sekvensdata ulæselige efter den rene-base-region.)

d) Gå med Plasmider: Med oprenset plasmid-DNA, strækninger af rene poly-"enkeltbase"-regioner (f.eks. hvis du kan få en ren læsning i både fremadgående og tilbagegående retning, fordi du kan oprette en contig fra begge læsninger for at genskabe det fulde PCR-produkt.

    Primer-Dimers: Typisk genererer primer-dimerer

70-bp ind i basen kaldes read og kan skjule de virkelige toppe. I tilfælde, hvor længere læsninger er involveret, vil prøver med ekstremt høje niveauer af UDT'er (efteroprydning) have yderligere UDT-toppe senere i sekvensen (

For det første, selvom størstedelen af ​​fragmenter af samme størrelse grundlæggende migrerer sammen som et bånd i en gel, er fragmenter af alle størrelser i prøven faktisk til stede i hele gelbanen. Selv under de bedste omstændigheder vil gel-rensede produkter således ikke være helt rene (selvom urenhederne faktisk ikke betyder noget i de 'bedste' tilfælde). Her gør manglen på god båndadskillelse situationen meget værre, og der vil sandsynligvis være høje niveauer af ikke-målskabeloner selv i en gel-oprenset prøve. fører til dårlig kvalitet af læsninger.

PCR Primer titreringer: En meget enkel fremgangsmåde køres et sæt af testreaktioner ved hjælp af serielt fortyndede primere. Denne primer-titreringstilgang vil sandsynligvis eliminere primer-dimere (ved at minimere sandsynligheden for, at primere kommer i kontakt med hinanden), medmindre primerne simpelthen er et meget dårligt design, der fremmer dimerisering. Det vil også minimere eller eliminere non-target priming, medmindre primerne blot matcher ikke-targets lige så godt som de gør målene. Efterhånden som primerkoncentrationerne falder, vil målbåndet blive stadig svagere, men det vil gøre det mindre hurtigt, end det vil ske for primer-dimere eller ikke-specifikke produkter.

Ideelt set på et tidspunkt kan målbåndet (vha

3-5 ul i gelbrønden) vil være tydeligt synlige (men ikke særlig lyse), og der vil ikke være nogen synlige primer-dimere eller andre ikke-specifikke produkter. I så fald skal du rense disse PCR-produkter og derefter bruge ækvivalenten til 3-5 ul af de originale PCR-produkter til at udføre DNA-sekventering.

  • Resterende primere: Selv rensede PCR-produkter kan indeholde resterende primere fra den oprindelige reaktion for at hjælpe med at udligne resterende primere, brug 1 ul sekventeringsprimer ved 10-20 uM (mod 2-5 uM).
  • BigDye: Normale niveauer af BigDye (f.eks. 0,5 ul i en 10 ul reaktion) kan forårsage to problemer med meget korte skabeloner.
    >> For det første bruger meget korte skabeloner ikke så meget af farveterminatorerne som lange produkter. Når de afsluttede reaktioner renses, kan det således være svært at fjerne nok af UDT'erne, blot fordi der er så mange tilbage.
    >> For det andet, hvis målet er meget kort, kan standardmængden af ​​BigDye skabe overdreven signalintensitet, fordi polymerasen hurtigt kan flytte til yderligere skabeloner. For højt signal kan forårsage problemer med basecalling.
    >> Helt ærligt, selv så lidt som 0,1 ul BigDye kan generere acceptable signalintensiteter for produkter, der er kortere end

Kan jeg sekventere genomisk DNA direkte?

4-kb vektorskabelon, det mindste input, der pålideligt vil generere et acceptabelt, omend lavt, signal er

20-25 ng. og stærkere signal kræver mindst 50-100 ng DNA. Hvis organismens genom blot var 25X så stort (dvs. 100 kb), ville du have brug for mindst 500 ng DNA for at have tilstrækkelige kopier til sekventering. Selv Mycoplasmas genomer overstiger imidlertid 1000 kb, hvilket ville kræve i størrelsesordenen 5 ug DNA-input. Det er højst usandsynligt, at sekventeringsreaktionen ville fungere med 5 ug DNA til stede. endsige med de milligram DNA-input, der ville være nødvendigt for mange andre organismer.

Hvordan opnår man bedre kloningsresultater?

Både 'prøve-til-prøve' og 'eksperiment-til-eksperiment'-konsistens forbedres, hvis du:

en) Minimer variation: Hold bakterievækstperioder og behandlede mængder konsekvente.
b) Minimer væksttiden: giver bedre DNA-kvalitet og bedre sekventeringsresultater.

Vækst natten over ved 37 o C (dvs.

14 timer) kan producere kulturer med så mange celler, at de 'overvælder' kapaciteten af ​​kommercielle oprensningskolonner. Yderligere resulterer det i celler, der er i sen log-fase/tidlig stationær fase, hvor ikke alt det genomiske DNA er intakt og konjugeret til cellevæggen.

I modsætning hertil har vækst natten over ved 30 o C eller begrænset vækst ved 37 o C (dvs. 5 - 8 timer) tendens til at producere DNA af bedre kvalitet fra minipreps end standard vækst natten over ved 37 o C. Endelig er sekventeringsresultater ofte bedre, hvis renset af 'midi'-præp i stedet for med miniprep-størrelse kolonner.

Hvordan undgår man flere signaler?

Oftest vil flere signaler i dine sekvensdata opstå fra eksistensen af ​​flere skabeloner i sekventeringsreaktionen (selvom lejlighedsvis vil sekventeringsprimeren finde mere end én passende placering på skabelonen). Se også Hvad forårsager et lavniveausignal efter PCR-stoppet? for en anden mulighed.

en) Klonet DNA: Enten er der flere kopier af en vektor (som indeholder forskellige indsættelser) i den samme celle, eller også har du undladt at vælge en ren, enkelt koloni. Når inserterne er af forskellig størrelse, kan begge problemer undgås ved at teste klonet DNA med standard PCR.

Dine chancer for en ren koloniplukning øges ved at plukke kolonier, når de lige knap er store nok til at være synlige, så de stadig er godt adskilt. Yderligere vil en undersøgelse af kolonierne under et lavenergiomfang afsløre tilfælde, hvor en tilsyneladende koloni faktisk blev genereret af to tilstødende celler (koloniens form vil være 'dumb-bell'-agtig snarere end cirkulær). At plukke kolonier tidligt sikrer også, at der ikke har været tilstrækkelig tid til, at satellitkolonierne (dvs. dem, der mangler antibiotikaresistensgenet fra indsættelsen) kan vokse ved siden af ​​de 'rigtige' kolonier. Typisk forhindrer antibiotika blot vækst af bakterierne, så når først antibiotika-resistente kolonier begynder at udskille (på tallerkener eller i en bouillon) forbindelser, der neutraliserer antibiotika, vil bakterierne fra satellitkolonier begynde at vokse og som sådan, vil deres indsatser også høstes, når DNA'et ekstraheres. Hvis sekventering udføres med vektorprimere, vil der være et dobbeltsignal, hvis det udføres med insertprimere, signalet kan være svagere end forventet.

b) PCR produkter: Typisk fremgår eksistensen af ​​flere PCR-produkter i en reaktion fra et simpelt agarosegeleksperiment, i det tilfælde skal du i det mindste gel-rense DNA'et. Men nogle gange er endda et enkelt rent bånd faktisk sammensat af flere PCR-produkter i det tilfælde (som du vil opdage gennem sekventering), skal du først klone DNA'et.

c) Primer problem: Hvis din primer er nedbrudt i 5'-enden eller blev fremstillet med "n-1" (eller flere) nts (hvilket ville udelade nts på 5'-enden af ​​primeren på grund af den måde, primere syntetiseres på), vil generere skabeloner, som vil blive 'frame-shifted' på DNA-sequenceren.

Er det vigtigt at rense PCR-produkter til sekventering?

Bortset fra at fjerne potentielle kontaminanter, der kan lukke ned for en sekventeringsreaktion, er formålet med at rense PCR-produktet at fjerne de originale primere og andre PCR-reagenser. Ideelt set bør rensede skabeloner resuspenderes i en lav TE-buffer (f.eks. TVLE, 10 mM Tris, 0,05 mM EDTA pH 8), alternativt kan de resuspenderes i nukleasefrit vand, men problemerne nævnt i Valg af primer-resuspensionsbuffer ? gælder også for skabeloner.

Ikke desto mindre, selvom oprensning af PCR-produkterne stærkt anbefales, er det måske ikke afgørende. For eksempel, hvis PCR-produktet er tilstrækkeligt fortyndet, kan sekventering være vellykket uden først at rense PCR-produktet. Det er særligt vigtigt, at de originale PCR-primere fortyndes til det punkt, at de ikke vil generere mærkbare niveauer af sekventeret produkt –, ellers vil de originale primere introducere støj i signalet. Bestemmelse af det nødvendige niveau af fortynding er en empirisk proces. Ud over at fortynde PCR-produktet kan du bruge kits (f.eks. ExoSAP-IT&trade) til at eliminere de originale PCR-reagenser. Begge tilgange er blevet brugt med succes med prøver indsendt til Genomics Facility, men de bør bruges med passende forsigtighed.

Hvordan renser man DNA-skabeloner til sekventering?

en) PCR produkter: Forudsat en robust reaktion, vil en standard ethanol-udfældning (billig metode) ofte gøre et fremragende stykke arbejde med at eliminere resterende primere og primer-dimere, men brug ikke natriumacetat. da det sandsynligvis vil co-præcipitere de ikke-forbrugte primere ved høje nok koncentrationer til at generere flere signaler i dine sekventeringsreaktioner (på grund af tilstedeværelsen af ​​både fremadgående og omvendte primere). En bedre mulighed er at bruge 70-150 mM EDTA (tilgængelig fra Genomics Facility) som beskrevet i Templates_EtOH-EDTA_Preciptation.docx (til 96-brøndsplader) eller Sequencing-Templates EtOH-EDTA Preciptation.docx (til 1,5 ml rør) .

Bemærk dog, at nogle primere er særligt modstandsdygtige over for fjernelse af standard EtOH-EDTA-protokollen for sådanne primere, Genomics Facility har udviklet en 'proprietær' modificeret EtOH-EDTA-protokol, der effektivt fjerner primere og primer-dimere til niveauer, der er på ingen nævneværdig konsekvens for sekventeringsreaktionen. For at benytte dig af denne 'proprietære' metode, bedes du indsende den relevante onlineindsendelse til Genomics Facility.

b) Plasmider: Kommercielle kolonner giver den bedste skabelon til sekventering. Hvis du bruger en hjemmelavet teknik, så se venligst "Plasmid Prep"-dokumentet på hjemmesiden.

c) DNA Clean & Concentrator-5 Kit (distribueret af Genesee Scientific [Zymo Research-produkt]): For dem, der foretrækker kolonneteknologier, er dette et fremragende produkt, der både gør et godt stykke arbejde med at rense DNA-prøver og giver mulighed for eluering i meget små volumener (>6&mikrol). Som sædvanlig anbefaler vi eluering i TVLE (se Valg af primer-resuspensionsbuffer?) for at undgå problemer med pH-problemer eller mindre DNAse-kontamination, uden at det forstyrrer downstream-applikationer. Zymo angiver, at genvinding er 70-95% for DNA fra 50 bp til 10 kb som sådan, søjlen burde fjerne størstedelen af ​​primere (typisk

18-25 bp oligos) &mdash, men i nogle tilfælde skal du muligvis bruge Select-a-Size Columns (D4080) i stedet for at opnå tilstrækkelig primerfjernelse. især hvis primer-dimere er et problem. Du kan enten købe kolonner til dit laboratorium eller få prøver behandlet af Genomics Facility.

d) Noter vedrørende kommercielle kolonner: For det første, hvis du bruger en kolonne til at fjerne primere og primer-dimere, skal du læse produktspecifikationerne meget omhyggeligt. nogle sæt beholder tilstrækkelige mængder primer til at skabe problemer med sekventering. For det andet afslutter mange protokoller med en 5-minutters centrifugering efter tilsætning af vaskeethanolen, men ethanoldamptrykket under kolonnen forhindrer noget ethanol i at spinde ud af filteret. Drej således vaskeethanolen ud (1 min), dump ethanol- og blotopsamlingsrørene på en Kimwipe, og afslut med en sidste centrifugering (5 min).

Hvor meget DNA skal man bruge i en sekventeringsreaktion?

Den mest almindelige sekventeringsfejl er at bruge for meget DNA (enten volumen eller mængde).

(1) Bind: højere volumener øger potentialet for at inkludere 'reaktionsdræbende' kontaminanter i blandingen.

(2) Antal: overdreven initial skabelon har to synergistiske virkninger, som kan resultere i dramatisk reduceret sekvenslæselængde: (a) BigDye-reagenser udtømmes ved at lave meget små fragmenter, og (b) for store mængder af små fragmenter tilstopper kapillæren på sequenceren, hvilket forhindrer injektion af længere fragmenter.

Oftest vil forskere bruge et standardspektrofotometer til at bestemme koncentrationen af ​​DNA-prøver. Hvis de er virkelig samvittighedsfulde, vil de bruge et specialiseret spektrofotometer såsom Nanodrop. Det er imidlertid afgørende at erkende, at disse instrumenter har betydelige begrænsninger for sådant arbejde (se Hvorfor er spektrofotometre "dårlige", og hvad skal man gøre i stedet?), og at der er bedre alternativer (se nedenfor).

Under alle omstændigheder, medmindre dine protokoller konsekvent genererer passende koncentrationer af DNA til sekventering, vil du spare tid og penge ved at tage skridt til korrekt at kvantificere dine DNA-skabeloner før sekventering af dem. I sidste ende vil du bruge DNA-koncentrationsestimaterne til at bestemme, hvor mange & mikrol skabelon, der skal tilføjes til sekventeringsreaktionen for at bruge den optimale masse af DNA.

  • Det er tilrådeligt at køre i det mindste nogle af plasmidprøverne på en agarosegel, som diskuteret i Hvorfor er spektrofotometre "dårlige", og hvad skal man gøre i stedet?.
  • Ellers er det normalt tilstrækkeligt at tage A260/A280-aflæsninger på en tilfældig prøve af oprensede skabeloner og fortynde DNA'et i overensstemmelse hermed. Ikke desto mindre, hvis aflæsningerne ikke er relativt konsistente, skal du behandle alle skabeloner og derefter, for fremtidige prøver, se Hvordan opnår man bedre kloningsresultater? for at minimere forekomsten af ​​variantudbytter.
  • Endelig, medmindre dine prøver er meget koncentrerede, vil du opnå mere pålidelige resultater fra et spektrofotometer med lavt volumen. Nanodråber kan være særligt nyttige i denne henseende og vil også give nogle fingerpeg om tilstedeværelsen af ​​forurenende salte (i absorbansgrafen, som diskuteret i Nanodrop tips.pdf) se også Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf.

jeg) Mulighed A. billig: Rens nok PCR-produkt til en gyldig A260-aflæsning (fratræk din falske aflæsning), og lav et seriel fortyndingsreferencefoto ned til 1 ng i en ren 2 % gel. Med ethidiumbromid bør 1 ng-banen ikke vise et synligt bånd, men et ekstremt svagt bånd bør vises med 3-5 ng DNA. Sammenlign produkter med referencefoto for at estimere nødvendige fortyndinger.

ii) Mulighed B. dyr: Kvantificer dit rensede PCR-produkt med et instrument, der er afhængig af et farvestof, der interkalerer i dsDNA'et. For eksempel kan du bruge Agilent Bioanalyzer (koncentration, størrelsesfordeling og prøveintegritet) eller Qubit (kun koncentration). Begge platforme har flere forskellige sæt til forskellige applikationer yderligere, de har begge deres fordele og ulemper. Desværre er begge muligheder dyre, hvis du har brug for nøjagtigt at kvantificere adskillige prøver.

iii) Mulighed C. billig: Kør, hvad der svarer til 1 &mikrol & 3 &mikrol prøver (renset eller rå) i en ren 2% gel (farvet med ethidiumbromid), bland f.eks. 5 &mikrol af hver skabelon med 20 μl påfyldningsfarve (fortyndet til 20% med TVLE) ) og elektroforese derefter 5 vs. 15 &mikrol i tilstødende brønde for hver prøve. Hvis du kører rå (dvs. urensede) PCR-produkter, skal du bruge resultaterne til at bestemme volumener til eluering af dit DNA fra en søjle (eller til resuspension, hvis du foretager en ethanolpræcipitation).

Kriterier: Hvis 1-&mikrolbåndet knap er synligt, og 3-&mikrolbåndet er svagt (men distinkt), skal du bruge 1-3 μl DNA i sekventeringsreaktionen. I modsætning hertil skal du bruge >3 µl-skabelon, hvis kun 3 µl-båndet er synligt, eller brug en fortynding af din skabelon, hvis 1 &mikrol-båndet er lyst.

I dette Weak-Strong PCR products.jpg eksempel kan alle skabelonerne være egnede til brug med 1-3 &mikrol i en sekventeringsreaktion. Men 'A' er på vej til at blive for lysende 'B' er perfekt 'C' bliver noget svag 'D' er ekstremt svag (især for et 1-kb-produkt, som burde være

2 gange så lysstærkt som et 500-bp-produkt for det tilsvarende antal kopier) og mindst 6 ul skal bruges, og selv

450-bp-produkt til 'E' ville sandsynligvis gøre det meget bedre, hvis

6 μl skabelon blev brugt. På billedet er båndstørrelserne refereret til Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler (#1708352).

I modsætning hertil, i dette Strong PCR products.jpg eksempel, ville sekventeringsreaktioner ved hjælp af 1-3 &mikrol DNA være passende for alle prøverne. Selvom prøver som 'A' er perfekte til at bruge 1-3&mikrol, er prøver som 'B' på grænsen til at være for lyse, og du vil måske overveje at bruge

1 &mikrol i stedet for 3 &mikrol for sådanne prøver. På billedet er båndstørrelserne refereret til Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler (#1708352).

Hvorfor er spektrofotometre "dårlige", og hvad skal man gøre i stedet for?

Okay. så "Bad" er en dramatisk overdrivelse. Men med hensyn til DNA har standardspektrofotometre nogle væsentlige begrænsninger:

  1. PCR-produkter og plasmider: Det er afgørende, at prøven ikke overbelastes på gelen, ellers kan tilstedeværelsen af ​​flere produkter (af næsten samme størrelse) maskeres af de alt for brede og lyse bånd.
  2. PCR produkter: kan køres direkte i geler med den passende koncentration (baseret på fragmentstørrelse).
  3. Plasmider: ideelt set bør disse lineariseres først for at eliminere de oprullede og supersnoede former.
    • Restriktionsenzym(er) kan bruges til at skære vektoren enten én gang (generering af et enkelt, langt fragment) eller to gange (for at frigive insertet fra vektoren), begge metoder kan have deres fordele.
    • Linearisering af et plasmid kan også nogle gange være nyttigt for at få bedre sekventeringsresultater, selvfølgelig, restriktionsstedet kan ikke være inden for den ønskede aflæsning eller mellem den ønskede aflæsning og primerstedet!

Hvordan fortolker man 260/230 & amp 260/280 OD-forhold?

Skal jeg bruge en Nanodrop til at kvantificere DNA?

220-300 nM, kan Nanodrop give nyttige oplysninger til stort set ingen omkostninger. Man skal dog være opmærksom på de forskellige faktorer, der kan skævvride aflæsninger fra en Nanodrop for yderligere detaljer, se venligst Nanodrop tips.pdf og Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf.

Nanodrop guide til nukleinsyrer?

Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf giver supportoplysninger om nukleinsyremålinger, der er relevante for Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 og 1000 spektrofotometre. Se venligst den modelspecifikke brugermanual for mere detaljerede instrument- og softwarefunktionsrelaterede oplysninger.

Det patenterede NanoDrop™ prøveopbevaringssystem anvender overfladespænding til at holde 0,5 μL til 2 μL prøver på plads mellem to optiske fibre. Ved hjælp af denne teknologi har NanoDrop spektrofotometre evnen til at måle prøver mellem 50 og 200 gange mere koncentrerede end prøver målt med en standard 1 cm kuvette.

Nanodrop guide til protein?

Nanodrop Protein Guide.pdf er beregnet til at give nogle grundlæggende proteinmålingsstøtteoplysninger til direkte A280-metoder, der er relevante for Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 og 1000 spektrofotometre. Se venligst den modelspecifikke brugervejledning for mere detaljeret instrument- og softwarefunktion relateret information.

Det patenterede NanoDrop™ prøveopbevaringssystem anvender overfladespænding til at holde 0,5 μL til 2 μL prøver på plads mellem to optiske fibre. Ved hjælp af denne teknologi har NanoDrop spektrofotometre evnen til at måle prøver mellem 50 og 200 gange mere koncentrerede end prøver målt med en standard 1 cm kuvette. Protein A280-metoden er anvendelig til oprensede proteiner, der indeholder Trp-, Tyr-rester eller Cys-Cys-disulfidbindinger og udviser absorbans ved 280 nm. Denne metode kræver ikke generering af en standardkurve og er klar til proteinprøvekvantificering ved softwarestart. Kolorimetriske assays såsom BCA, Pierce 660 nm, Bradford og Lowry kræver standardkurver og bruges mere almindeligt til ukarakteriserede proteinopløsninger og cellelysater.


Billede 3

DNA'et i brønde 50, 51, 52, 53, 54 og 55 nedbrydes. Koncentrationen af ​​DNA'et er meget høj i brønden 59 og kan derfor ikke komme ud af brønden. Kammen fjernes ikke korrekt fra brønde 56, 59, 60, 61 og 62. DNA-prøverne er stærkt forurenet med proteiner såvel som RNA'er (59 til 62).


Indhold

2-D elektroforese begynder med elektroforese i den første dimension og adskiller derefter molekylerne vinkelret fra den første for at skabe et elektroferogram i den anden dimension. Ved elektroforese i den første dimension adskilles molekyler lineært i henhold til deres isoelektriske punkt. I den anden dimension adskilles molekylerne derefter ved 90 grader fra det første elektroferogram efter molekylvægt. Da det er usandsynligt, at to molekyler vil være ens i to forskellige egenskaber, er molekyler mere effektivt adskilt i 2-D elektroforese end i 1-D elektroforese.

The two dimensions that proteins are separated into using this technique can be isoelectric point, protein complex mass in the native state, or protein mass.

Separation of the proteins by isoelectric point is called isoelectric focusing (IEF). Thereby, a pH gradient is applied to a gel and an electric potential is applied across the gel, making one end more positive than the other. At all pH values other than their isoelectric point, proteins will be charged. If they are positively charged, they will be pulled towards the more negative end of the gel and if they are negatively charged they will be pulled to the more positive end of the gel. The proteins applied in the first dimension will move along the gel and will accumulate at their isoelectric point that is, the point at which the overall charge on the protein is 0 (a neutral charge).

For the analysis of the functioning of proteins in a cell, the knowledge of their cooperation is essential. Most often proteins act together in complexes to be fully functional. The analysis of this sub organelle organisation of the cell requires techniques conserving the native state of the protein complexes. In native polyacrylamide gel electrophoresis (native PAGE), proteins remain in their native state and are separated in the electric field following their mass and the mass of their complexes respectively. To obtain a separation by size and not by net charge, as in IEF, an additional charge is transferred to the proteins by the use of Coomassie Brilliant Blue or lithium dodecyl sulfate. After completion of the first dimension the complexes are destroyed by applying the denaturing SDS-PAGE in the second dimension, where the proteins of which the complexes are composed of are separated by their mass.

Before separating the proteins by mass, they are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) along with other reagents (SDS-PAGE in 1-D). This denatures the proteins (that is, it unfolds them into long, straight molecules) and binds a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's length. Because a protein's length (when unfolded) is roughly proportional to its mass, this is equivalent to saying that it attaches a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's mass. Since the SDS molecules are negatively charged, the result of this is that all of the proteins will have approximately the same mass-to-charge ratio as each other. In addition, proteins will not migrate when they have no charge (a result of the isoelectric focusing step) therefore the coating of the protein in SDS (negatively charged) allows migration of the proteins in the second dimension (SDS-PAGE, it is not compatible for use in the first dimension as it is charged and a nonionic or zwitterionic detergent needs to be used). In the second dimension, an electric potential is again applied, but at a 90 degree angle from the first field. The proteins will be attracted to the more positive side of the gel (because SDS is negatively charged) proportionally to their mass-to-charge ratio. As previously explained, this ratio will be nearly the same for all proteins. The proteins' progress will be slowed by frictional forces. The gel therefore acts like a molecular sieve when the current is applied, separating the proteins on the basis of their molecular weight with larger proteins being retained higher in the gel and smaller proteins being able to pass through the sieve and reach lower regions of the gel.

The result of this is a gel with proteins spread out on its surface. These proteins can then be detected by a variety of means, but the most commonly used stains are silver and Coomassie Brilliant Blue staining. In the former case, a silver colloid is applied to the gel. The silver binds to cysteine groups within the protein. The silver is darkened by exposure to ultra-violet light. The amount of silver can be related to the darkness, and therefore the amount of protein at a given location on the gel. This measurement can only give approximate amounts, but is adequate for most purposes. Silver staining is 100x more sensitive than Coomassie Brilliant Blue with a 40-fold range of linearity. [3]

Molecules other than proteins can be separated by 2D electrophoresis. In supercoiling assays, coiled DNA is separated in the first dimension and denatured by a DNA intercalator (such as ethidium bromide or the less carcinogenic chloroquine) in the second. This is comparable to the combination of native PAGE /SDS-PAGE in protein separation.

IPG-DALT Edit

A common technique is to use an Immobilized pH gradient (IPG) in the first dimension. This technique is referred to as IPG-DALT. The sample is first separated onto IPG gel (which is commercially available) then the gel is cut into slices for each sample which is then equilibrated in SDS-mercaptoethanol and applied to an SDS-PAGE gel for resolution in the second dimension. Typically IPG-DALT is not used for quantification of proteins due to the loss of low molecular weight components during the transfer to the SDS-PAGE gel. [4]


  • Magnification is the ability to make small objects seem larger, such as making a microscopic organism visible.
  • Resolution is the ability to distinguish two objects from each other.
  • Light microscopy has limits to both its resolution and its magnification.
  • airy disks: In optics, the Airy disk (or Airy disc) and Airy pattern are descriptions of the best-focused spot of light that a perfect lens with a circular aperture can make, limited by the diffraction of light.
  • diffraction: the breaking up of an electromagnetic wave as it passes a geometric structure (e.g., a slit), followed by reconstruction of the wave by interference

Magnification is the process of enlarging something only in appearance, not in physical size. This enlargement is quantified by a calculated number also called &ldquomagnification. &rdquo The term magnification is often confused with the term &ldquoresolution,&rdquo which describes the ability of an imaging system to show detail in the object that is being imaged. While high magnification without high resolution may make very small microbes visible, it will not allow the observer to distinguishmellem microbes or sub-cellular parts of a microbe. In reality, therefore, microbiologists depend more on resolution, as they want to be able to determine differences between microbes or parts of microbes. However, to be able to distinguish between two objects under a microscope, a viewer must first magnify to a point at which resolution becomes relevant.

Resolution depends on the distance between two distinguishable radiating points. A microscopic imaging system may have many individual components, including a lens and recording and display components. Each of these contributes to the optical resolution of the system, as will the environment in which the imaging is performed. Real optical systems are complex, and practical difficulties often increase the distance between distinguishable point sources.

At very high magnifications with transmitted light, point objects are seen as fuzzy discs surrounded by diffraction rings. These are called Airy disks. The resolving power of a microscope is taken as the ability to distinguish between two closely spaced Airy disks (or, in other words, the ability of the microscope to distinctly reveal adjacent structural detail). It is this effect of diffraction that limits a microscope&rsquos ability to resolve fine details. The extent and magnitude of the diffraction patterns are affected by the wavelength of light (&lambda), the refractive materials used to manufacture the objective lens, and the numerical aperture (NA) of the objective lens. There is therefore a finite limit beyond which it is impossible to resolve separate points in the objective field. This is known as the diffraction limit.


Estimate apparent molecular mass for unknowns

Relative mobility should be calculated for each band of interest and the standard curve used to estimate apparent molecular mass. Because the relationship between mass and Rf is logarithmic, one should interpolate the standard curve data rather than use a trendline that may miss some of the data points. It is especially important to avoid extrapolating the standard curve, since even the logarithmic relationship begins to break down in the top 20% or so of a gel. One can report the mass of an unknown to exceed that of the highest mass standard, but cannot estimate a molecular mass for an unknown with Rf smaller than that of any of the standards. For example, if the Rf for the myosin standard (205 kDa) was 0.18 and the Rf for unknown 1 was 0.15, one reports that unknown 1 had apparent molecular mass > 205 kDa.

Consider resolution in the appropriate region of a gel and thickness of the band of interest when determining significant figures with which to report a mass estimate. For example, suppose the distance between 97,000 and 116,000 kDa standards is 0.5 cm and a band between them is 1 mm thick. You have resolution to the nearest 4,000 Daltons. An estimate of, say, 110 kDa should probably be written as 110 ± 4 kDa.


STING condensates on ER limit IFN response

STING is a key player in the IFN response to cytosolic DNA, and its multimerization is commonly associated with activation of the pathway. A new study now shows that STING forms ‘puzzle’-like condensates to limit the IFN response and constrain antiviral immune activation.

Formation of higher-order assemblies including liquid and gel condensates has recently emerged as a major mechanism of signal transduction in innate immunity 1 . Indeed, activation of pathways through multimerization of sensor and adaptor proteins is known for Toll-like receptor signalling 2 , inflammasome activation 3 , retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) 4 and cyclic GMP–AMP synthase (cGAS) 5 nucleic acid detection, as well as many others. However, the question as to whether and how a multimerization principle may also be involved to inhibit immune pathways has not been fully addressed. I dette nummer af Naturens cellebiologi, Yu et al. report that excess 2′,3′-cyclic GMP–AMP (2′,3′-cGAMP) induces STING to phase separate on the endoplasmic reticulum (ER) in a puzzle-like structure, thereby preventing STING overactivation 6 .


Restriction Digestion/Gel Electrophoresis Assignment 1

What we're going to do now is give you some experimental results and let you interpret them, so let's jump right in. You have performed Restriction Digestion and Agarose Gel Electrophoresis on a plasmid you purified, using 3 different Restriction Enzymes, and the gel is shown below. Unfortunately, you forgot to label your tubes or keep good records, and the only things you can remember about the experiment are that your standards are in Lane 5 and your uncut control is in Lane 1, and that you loaded roughly the same amount of total DNA in your sample lanes (1-4). Hey, at least you remembered that much!

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?

3. When DNA appears as a messy, continuous band as it does at the bottom of Lane 3, rather than independent, discreet bands, the effect is known as smearing. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3? You should be able to come up with at least two.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?

Answers to Questions

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?    The enzyme digests the plasmid in two places. It is important to think about the state of the DNA before digestion. The DNA used in this experiment was a plasmid, and plasmids are circular. If you cut a circle once, you get one linear fragment. You must cut it a second time to get 2 linear fragments like in Lane 2. The data does seem reasonable because if you add up the approximate sizes of the resulting fragments (roughly 4 kb and 2.5 kb), you get the original size of 6.5 kb. Lastly, it is likely that the enzyme used recognizes a sequence of 6 bases. 6-cutters, if you'll recall, cut an average of once every 4,096 bases. This is just an average, however, so in this case where we have a piece of DNA 6,500 bp long, cutting twice is very reasonable.

3. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3?    In general terms, smearing is when you have many bands together close enough in size that you cannot distinguish between adjacent bands (i.e., no resolution). With beginning molecular biologists, the most likely reason for the smearing is contamination by some stray nuclease that degraded the DNA into dozens, hundreds, or even thousands of little pieces. Another beginning mistake is to use the wrong buffer, wrong temperature, or wrong conditions. Any or all of these could make the enzyme behave badly, including cutting away at your DNA at multiple, random sites. However, as you do more and more experiments like this, personal error becomes less of a concern and you need to start thinking in terms of the science. If this experiment was performed without significant error, the likely explanation is that a 4-base cutter was used. Cutting an average of once every 256 bases in a 6.5 kb plasmid yields roughly 25 fragments, all smaller than the original. It is unlikely that one could see 25 individual fragments of such a small size, and the smearing pattern is probably what would be detected.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?    If you said twice, you are correct, but let's see if you were correct for the right reasons. In question 2, it was pointed out that to get two fragments from a circular piece of DNA, you need two cuts. So far so good. It was also mentioned that the total size of the resulting DNA fragments must add up to the original size. Uh oh--they don't, do they? Looking at the gel you see one band approximately 6.5 kb and one large band at roughly 3 kb. Does 6.5 + 3 = 6.5? Not in this class.

Science doesn't lie, it's just sometimes hard to interpret. So break it down. Is there anything significant about 6.5 kb? Yes, it's the size of the original plasmid. This, plus the fact that there is a band in the uncut control (Lane 1) which migrates to the same position, should suggest to you that not all of your DNA was digested (a common occurrence). This leaves the band around 3 kb. Could that band be 3.2 or 3.3 kb instead of 3.0? Easily. Unless we plot a standard curve, we're just approximating anyway. Is there anything significant about 3.3 kb? Yes, it's about half of our original sample. If the enzyme cut the plasmid into two roughly equal sized pieces, those pieces would run about the same, and would likely be indistinguishable on a gel. This is further supported by the information about this experiment which states that roughly equal amounts of DNA were loaded into Lanes 1-4. Notice how much darker the 3 kb band in Lane 4 is than the bands in Lane 2. There is twice as much DNA in that band than there is in either of the bands in Lane 2, and the data supports this conclusion.