Information

Måling af Drosophila-træk uden dødelig eller lav skade

Måling af Drosophila-træk uden dødelig eller lav skade



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeg forsøger at generere nogle kandidategenskaber til at måle i et fitnessassay af vildtype-udavlede (labpopulation) fluer. Det vigtigste træk, jeg vil måle, er levetid.

Jeg leder efter nogle yderligere egenskaber, som kan være målt fra de samme fluer som dem i levetidsanalysen uden at skade eller dræbe fluen i processen. For eksempel kunne jeg måle vinger ved hjælp af en teknik udviklet af Houle Lab kaldet WingMachine. Jeg tænker, at jeg også kunne lave nogle andre tiltag med samme udstyr, benlængde mm.

Egenskaberne bør også være til stede hos begge køn (kan være monomorfe eller dimorfe) og hurtige at måle; Jeg sigter efter 200-250 mål/samlinger/billeder om dagen. Egenskaber, der kan måles korrekt hos en flue, der er død af alderdom, ville også fungere. Træk kan være morfologiske, adfærdsmæssige osv...

Hvilke andre egenskaber kan gøres på denne måde?


Du kunne lave negative geotaksis (klatring) assay, (larve eller voksen) bevægelsesanalyser, % hjernevakuolisering (efter fluerne dør), labyrinttest. Der er sikkert meget mere, men det er alt, hvad jeg kan komme i tanke om, som ikke er dødelige og kan anvendes på hanner og hunner og også noget larvearbejde.

Du kunne måske overveje at udføre sultanalyser og levetid i nogle af dine befolkninger.


Rhipicephalus (Boophilus) Microplus

BYC blev oprenset fra nylagt Rhipicephalus (Boophilus) mikroplus æg homogeniseret i tris-HCl buffer, pH 7,4 indeholdende sojabønnetrypsinhæmmer, leupeptin, antipain og benzamidin. Oprensning blev opnået ved hjælp af ultracentrifugering efterfulgt af to kromatografiske trin, udført i DEAE-toyopearl ionbytning og Sephacryl S-200 gelfiltreringssøjler. Når den er oprenset, præsenterer denne proteinase sig selv som to polypeptider, der begge svarer til pro-enzymer med 54 og 49 kDa. Ved aktivering på sure pH'er (3,5) bearbejdes disse pro-enzymer autokatalytisk til den 47 kDa aktive form af enzymet [2]. I alle disse former opfører enzymet sig altid som en monomer. Proteinsekvensen er homolog med asparaginproteinaser fra andre leddyr såsom gul febermyg Aedes aegypti [8] og fra andre organismer såsom fluke Schistosoma mansoni [9] med omkring 35 % sekvensidentitet.

Sekundær struktur forudsigelse for BYC indikerer et højt β-sheet indhold, en typisk karakteristik af asparaginale endopeptidaser bekræftet af cirkulære dikroisme spektre af native BYC [3].

Det mest karakteristiske strukturelle træk ved BYC, sammenlignet med andre asparaginproteinaser, er manglen på en af ​​de katalytiske aspartatrester. Ikke desto mindre er dette ikke den eneste mærkbare forskel. Faktisk er regionen i nærheden af ​​positionen af ​​den manglende Asp-rest af BYC også forskellig fra andre asparaginproteinaser, eftersom hele S2-understedet ikke findes i denne peptidase. I silico modellering af BYC tertiær struktur baseret på den humane proteinase chymosin (kapitel 5) tyder på, at en serinrest i BYC er i den position, som oprindeligt var besat af den manglende Asp-rest fra BYC. Ikke desto mindre synes denne forudsigelse ikke at være pålidelig, da manglen på et BYC-cysteinpar i denne region kan føre til lokal modifikation af konformation i sammenligning med andre asparaginale endopeptidaser [3]. På denne måde kunne kun en fuldstændig opløsning af BYC-strukturen sammen med stedsrettede mutageneseundersøgelser besvare dette spørgsmål, og disse undersøgelser er desværre ikke blevet udført indtil videre.


'Cholesterol efflux capacity (CEC)'-assayet er simpelt in vitro mål for kapaciteten af ​​individuelle sera til at fremme det første trin af den omvendte kolesteroltransportvej, leveringen af ​​cellulært kolesterol til plasma HDL.

Denne gennemgang beskriver cellebiologien af ​​denne model og vurderer kritisk dens anvendelse som en markør for kardiovaskulær risiko. Vi beskriver veje for cellekolesteroleksport, nuværende cellemodeller brugt i CEC-analysen med deres begrænsninger og overvejer det bidrag, som måling af serum CEC giver til vores forståelse af HDL-funktion in vivo.


Resultater og diskussion

Vores eksperimentelle begrundelse for at teste hypotesen om, at ressourceniveauer havde begrænset kvindelige reaktioner på forhøjede seksuelle konflikter, var at (1) udlede karakteren af ​​det selektive miljø, der opleves ved at måle de vigtigste drivkræfter for frieri og parringsfrekvens inden for alle behandlinger under den eksperimentelle evolution, og (2) implementere standardiserede levetids- og fitnessassays for alle regimer, på samme diæt og reproduktive forhold, i "konflikt" og "ingen konflikt" assays. Dette muliggjorde direkte sammenligninger af levetid, aldring og fitness hos individer afledt af de rige og fattige, høje, mellemstore og lave seksuelle konfliktregimer. Replikerede målinger taget ved forskellige generationer under udvælgelse tillod os også at spore evolutionære reaktioners bane over tid.

SELEKTIVT MILJØ OPLEVET I DE RIGE OG FÅRE RESOURCER SEXUELLE KONFLIKTREGIMMER

Målinger af det selektive miljø under eksperimentel evolution viste, at kvinder fra højkonfliktregimerne (dvs. MB) som forventet oplevede signifikant forhøjet frieri og parring sammenlignet med medium konflikt lige køn (ES) og lavkonflikt (FB) hunner, og at dette blev opretholdt over tid (Supporting Information Fig. S1A,B). Dette antydede, at intensiteten af ​​udvælgelse, der stammer fra seksuel konflikt, var ens for et givet kønsforhold på begge ressourceregimer. Det er dog vigtigt at bemærke, at vi ikke havde direkte mål for selektionsstyrken hos kvinder. Når det er sagt, synes frieri og parringsfrekvens-adfærd målt som vores indirekte proxy for selektion at være nøgledrivere for kvindelig modstand (Wigby og Chapman 2004). Da disse konfliktindikatorer var ens inden for kønsforholdsbehandlinger på tværs af ressourceniveauer, er det derfor rimeligt at udlede, at de selektive nøglekræfter, der driver kvindelig modstand, også var ens. Vi kan ikke udelukke andre muligheder, som endnu ikke er testet, for eksempel at en han med høj kondition fra det rige kostregime kan skade en hun mere ved hver parring end et tilsvarende dårligt kostregime fra en han med lav kondition. Direkte test af denne idé er endnu ikke blevet udført, selvom undersøgelser af de nærliggende ernæringsmæssige virkninger af en mands evne til at påvirke postmating-reaktioner hos kvinder (Fricke et al. 2008) viste ingen beviser for, at mandlig ernæring på de niveauer, der er pålagt her, påvirkede den relative andel af faderskab til første eller anden parrende hanner, selvom der var nogle effekter på evnen hos de første parrende hanner til at fremkalde refractoriness hos hunner. Ressourcefattige fluer brugte mindre tid på føden (Fig. S1C), og inden for de rige føderegimer viste højkonfliktfluer (MB) lavere fødebelægning. Dette tyder på, at den høje frekvens af mandlig frieri og parring kunne have forhindret hunner i at få adgang til maden, hvilket potentielt forværrede hannernes skadelige virkninger på hunnerne.

REAKTION AF LIVSLÆNGDE, ALDRING OG PARRINGSHYPPIGHED PÅ SEXUEL KONFLIKT I RIGE OG DÅRLIGE RESSOURCER

1. Somatisk vedligeholdelse – basislinjeoverlevelse og aldring under "ingen konfliktanalyse"-forhold: Vi analyserede først overlevelsen af ​​en gang parrede individer ved generation (gen) 47 under "ingen konflikt" assaybetingelser. Individer blev masseparret ved starten af ​​eksperimenterne (placeret med vildtype individer af det modsatte køn i 24 timer) og derefter holdt de alle på standard SY (rigt) medium i enkeltkønnede hætteglas indtil døden. Kvinder med lavkonflikt (FB) levede længere end højkonfliktkvinder (MB) i de fattige, men ikke rige ressourceregimer (fig. S2A), i overensstemmelse med forudsigelsen om, at kvinder med en evolutionær historie med høj konflikt i fattige regimer havde kompromitteret somatisk vedligeholdelse. Der så ikke ud til at være nogen virkninger af kønsforholdet på mænds levetid. Fordelingen af ​​levetid (Fig. S2A) blev dog stærkt skæv, hvilket motiverede en to-trins model (Supporting Information) bestående af overlevelse til en tærskel (@32 dage, Fig. S3) efterfulgt af levetidsanalyse af størstedelen af de kohorter, der dannede postthreshold-overlevende (fig. 1A).

Tærskel overlevelse: De fleste individer overlevede tærskelperioden, og derfor kom signalet om lang levetid fra posttærskelanalysen beskrevet nedenfor. Ikke desto mindre, inden for tærskelperioden, havde kvinder med høj konflikt (MB) (overlevelsessandsynlighed = 0,919 [0,895, 939]) signifikant lavere tærskeloverlevelse (Z = 3.107, Pjustere = 0,0076) end MB-mænd (overlevelsessandsynlighed = 0,963 [95 % CI = 0,944, 0,975]), hvorimod der ikke var nogen kønsforskel i FB-regimerne (sandsynlighed for overlevelse hos kvinder = 0,944 [0,922, 0,922, 0,960] mænd = 0,960] 0,947] Z = 1.064, Pjustere = 0,2874). En signifikant interaktion mellem kønsforhold og fokalsex (LRT = 9,3977, P = 0,0027) var også tydelig på grund af højere overlevelse hos mænd med høj (MB) over lavkonflikt (FB) regime (Z = 2.535, Pjustere = 0,0224). Der var ingen effekt af evolutionært ressourceregime på tærskeloverlevelse på tværs af nogen kønsratiobehandling (LRT = 0,6016, P = 0,4403). Resultaterne antydede, at kvinder med høj, men ikke lav konflikt havde reduceret tærskeloverlevelse i forhold til deres respektive mænd, hvilket var i overensstemmelse med forudsigelsen om, at deres somatiske vedligeholdelse var kompromitteret (fig. S3).

Postthreshold overlevelse: Cirka 94 % af alle ucensurerede individer overlevede til dag 32 og dannede således postthreshold-kohorterne (fig. 1A). Vi observerede signifikante interaktioner mellem fokalsex og kønsforhold (LRT = 4,5079, P = 0,0349) og fokalsex med diæt (LRT = 9,6881, P = 0,0013). Lavkonfliktkvinder (FB) levede længere end højkonfliktkvinder (MB), men dette var kun marginalt signifikant hos individer afledt af det dårlige ressourceregime (Pjustere = 0,0516). Generelt havde kvinder med lav konflikt (FB) konsekvent, men ikke signifikant, længere postthreshold-levetider end MB-hunner på tværs af begge ressourceregimer (FB-MB-levetid ± SEM = 1,91 ± 1,42 dage t10.2 = 1.344, Pjustere = 0,2929). Fokalsex var signifikant (LRT = 53,024, P < 0,0001) med kvinder, der har signifikant længere levetid end mænd, især hos individer fra lavkonflikt (FB) regimer med dårlige ressourcer (kvinde-mandlig levetid ± SEM = 4,37 ± 0,60 dage t2178.27 = 7.274, Pjustere < 0,0001 Fig. 1A).

Vi foreslår, at FB-hunner fra de fattige regimer levede længere end de andre kvinder i ingen konfliktanalysen, fordi deres selektive miljø var domineret af ressourceniveauer oplevet under den eksperimentelle udvikling. Derfor var responsen af ​​FB kvindelig levetid stærkt bestemt af de dårlige fødeniveauer, de oplevede, og af de fire kvindelige behandlinger var disse hunner mest tilbøjelige til at udvikle mekanismer til at understøtte somatisk vedligeholdelse. Dette var det modsatte af MB-hunner, der blev opretholdt på rige madregimer, hvis selektive miljø ikke var domineret af mangel på mad, men af ​​mandlig opmærksomhed/skade. Disse hunner reagerede på den kraft, der mest påvirkede fitness ved at modstå skade (se nedenfor). Dette blev understøttet af de spejlede svar i FB- og MB-hunnerne (der sammenligner ingen konfliktanalyse ved 47 generationer og konfliktanalyse ved 30 generationer) vist i fig. 1A versus B. Ligesom FB-hunner fra dårlige madregimer var udestående i "nej". konfliktanalyse," MB-hunner fra de rige madregimer var afvigere sammenlignet med alle andre kvinder i "konfliktanalysen."

Aldringshastighed: Ingen af ​​behandlingerne påvirkede ældningsprofilen (fig. S4A,B, S5A) eller ældningshastigheden signifikant (ωG) (Fig. 2). Ved første øjekast kan dette se ud til at modsige de betydelige effekter, der er observeret i analysen af ​​postthreshold-levetiden. Imidlertid blev aldringshastighedsanalysen udført på befolkningsskalaen med aldringsparametre afledt af sammenfatninger af ~100 individers levetidsdata. Dette kan have nedsat kraft og opløsning til at detektere forskelle, især i betragtning af variabiliteten mellem populationer i overlevelseskurveformer, som kan maskere forskellige befolkningsniveaubaner inden for de samme behandlinger.

Samlet set var resultaterne i overensstemmelse med forudsigelsen om, at investeringer i somatisk vedligeholdelse (levetid under ingen konfliktforhold) af lavkonflikt (FB) kvinder var relativt ubegrænset (ingen afvejning med modstand), hvorimod højkonfliktkvinder fra MB-eksperimentelle udviklingsregimer blev kompromitteret. Hvorfor de rige regime-hunner ikke levede længere samlet set er ikke helt klart, selvom vi har mistanke om, at der var stærkere levedygtighedsudvælgelse relateret til ressourceforbrugseffektivitet i det fattige ressourceregime.

2. Udvikling af resistens - Overlevelse, aldring og parring i fuldt reproduktive fluer ("konfliktanalyse"-betingelser). Vi analyserede derefter overlevelsesmønstre hos begge køn under fuldt reproduktive, "konfliktassay"-forhold (dvs. med fokale individer eksponeret kontinuerligt i et 50:50 kønsforhold til standard vildtype individer af det modsatte køn, og alle opretholdt på standarden [ rig] kost). To generationstidspunkter, 13 og 30, blev målt.

Levetid: Selvom vi ikke fandt nogen signifikante trevejsinteraktioner, var overlevelse signifikant påvirket af tovejsinteraktioner, der involverede generation, kønsforholdsbehandling og køn (kønsforhold × kost, LRT = 9,8897, P = 0,0467 kønsforhold × fokalsex, LRT = 11,9907, P = 0,0042 fokalsex × generation, LRT = 436,63, P = 0,0012). Der var også meget signifikante hovedeffekter af generation (LRT = 67.229, P < 0,0001) og fokalsex (LRT = 1608,6, P < 0,0001). For yderligere at undersøge interaktionerne opdelte vi datasættet efter kostregime og genanalyserede efterfølgende hver undergruppe separat.

Hos individer afledt af de ressourcerige regimer ændrede levetiden sig betydeligt over tid (generation × fokalsex, LRT = 277,04, P = 0,0010) og var forskelligt påvirket af kønsforholdsbehandling (kønsforhold × fokalsex, LRT = 13,2755, P = 0,0040). Her havde højkonflikt MB-hunner signifikant længere levetid end enten medium- (ES) eller lavkonflikt (FB) kvinder (FB < ES: t11.02 = –3.823, Pjustere = 0,0056 FB < MB: t11.24 = –6.477, Pjustere = 0,0001 ES < MB: t10.97 = –2.684, Pjustere = 0,0341 Fig. 1B og fig. S2B, S4C, D). I modsætning hertil, i de dårlige kostregimer, selvom levetiden blev forklaret af en interaktion mellem fokalsex og generation (LRT = 172,68, P = 0,0010) og efter hovedeffekter af fokalsex (LRT = 857,21, P = 0,0010) og generation (LRT = 33,139, P = 0,0010), fandt vi ingen effekt af kønsforhold på kvindens levetid. Resultaterne viste, at kun højkonflikt (MB) kvinder fra de rige ressourceregimer tilsyneladende kunne udvikle modstand, det vil sige mekanismer, der kunne lindre de skadelige virkninger af forhøjede seksuelle konflikter. Overensstemmelsen mellem denne levetidsrespons og et tidligere, uafhængigt udført eksperimentelt evolutionsforsøg (Wigby og Chapman 2004) viser robustheden af ​​dette resultat. I ingen af ​​de evolutionære kostregimer fandt vi en effekt af kønsforhold på mænds levetid (FB = ES = MB, alle Pjustere ≫ 0.05).

På tværs af begge ressourceniveauregimer så vi også en slående stigning i seksuel dimorfi i levetiden, efterhånden som den eksperimentelle udvikling fortsatte (fig. 1B, fig. S2B). Dette så ud til at være en bivirkning af opdrætsordningen (støttende information). Præcis hvorfor er endnu ikke klart, men det kunne afspejle kønsspecifikke afvejninger (Fairbairn 2013) som svar på selektion for at reproducere maksimalt på dag 10. Denne effekt var mere udtalt i det rige kostregime, hvor den signifikante hovedeffekt af fokal sex (LRT = 19.1988, P = 0,0022) skyldtes, at hunner havde signifikant kortere levetid end mænd. Den signifikante fokale køn × generationseffekt blev drevet af en 6-dages stigning hos mænd (gen 13 middel ± SEM = 47,99 ± 0,64 gen 30 = 53,70 ± 0,52 t193.07 = –6.806, P < 0,0001) og samtidig 12-dages fald i kvindens levetid (gen 13 middel ± SE = 41,52 ± 0,27 gen 30 = 29,21 ± 0,53 t15.07 = 20.110, P < 0,0001).

Aldringsparametre (α, β): Aldringsparametre viste signifikante hovedeffekter af fokalsex (F1,66 = 50.646, P < 0,0001), kost (F1,66 = 4.672, P = 0,0027), generation (F1,66 = 0.961, P < 0,0242) og kønsforhold (F2,66 = 2.084, P < 0,0304). Under modelforenkling blev fokalkøn × generationsinteraktionen signifikant (F1,58 = 37.175, P < 0,0001), som kan tilskrives et fald i den initiale dødelighed (α) for mænd mellem generation 13 og 30, hvorimod det modsatte skete hos kvinder (fig. S5B). Kvinder havde således en konsekvent højere dødelighedsstigning. Der var en marginalt højere initial dødelighed i befolkningen med dårlig kost og en lille stigning i dødeligheden på tværs af generationer (Fig. S5B). Generelt havde lavkonfliktregimer (FB) højere initial dødelighed og lavere dødelighedsstigning end ES eller højkonfliktregimer (MB). Analyse af ældningshastighedsparameteren (ωG) afslørede en hovedeffekt af diætregimet (LRT = 4.322, P = 0,04794) med et dårligt ressourceregime fluer, der ældes hurtigere end dem fra rige regimer, og en enkelt signifikant interaktion (fokalt køn × generation, LRT = 66,034, P = 0,0001). Kvindernes aldring var oprindeligt lavere end for mænd og steg over tid, hvilket resulterede i et signifikant fald i den gennemsnitlige levetid. I mellemtiden faldt mandlig aldring over tid (fig. S2B, S5B). Da denne interaktion blev fjernet, var der en signifikant hovedeffekt af generering (LRT = 4,729, P = 0,0317). Ved generation 30 korrelerede aldring hos kvinder omvendt med niveauet af seksuel konflikt (med aldringshastighedsparameteren ωG højere i FB > ES > MB Fig. 2A), selvom denne effekt var ikke-signifikant på grund af den reducerede effekt af aldringsanalysen på befolkningsniveau. Mønstret var i overensstemmelse med overlevelsesanalysen og understøttede eksistensen af ​​ressourceafhængig resistens over for mandlig induceret skade.

Parringsfrekvens: Der var ingen kønsforhold × aldersinteraktion (LRT = 5,1935, P = 0,0932) for parringsfrekvens på ressourcefattige regimer ved gen 13, men ved generation 30 var en stærk ikke-lineær effekt tydelig (LRT = 9,6866, P = 0,0055 Fig. 3). Højkonflikt (MB) og lavkonflikt (FB) regimer viste en signifikant stigning med alderen, og i MB regimer i særdeleshed en hurtigere acceleration (kønsforhold × aldersinteraktion, LRT = 16,2653, P = 0,0011). De tilsvarende ressourcerige regimer viste en konstant parringshastighed.FB steg dog betydeligt mere stejlt end for enten ES- eller MB-regimer, hvilket resulterede i signifikant højere parring samlet set (kønsforhold × aldersinteraktion, LRT = 7,5074, P = 0,0438 Fig. 3), hvilket kan være forbundet med højere parringsomkostninger og den observerede nedsatte overlevelse af FB-hunner, når de udsættes for vildtype-hanner. Der var ingen beviser for nogen kønsforhold × alder interaktioner for frieri.

Samlet antydede resultaterne af konfliktanalyserne, at forhøjet seksuel konflikt førte til udviklingen af ​​modstand hos kvinder afledt af det ressourcerige regime (Berg og Maklakov 2012 Wigby og Chapman 2004) potentielt på grund af begrænsninger med somatisk vedligeholdelse (Chapman 2006 Houslay et al. al. 2015). Dette var tydeligt som en reduktion i levetiden og stigningen i aldring af fuldt reproduktive lavkonflikt-hunner (FB) i forhold til ES og højkonflikt- (MB)-hunner afledt af de ressourcerige regimer, uden en sådan effekt hos de fattige diæt regimer. Konstateringen af, at MB-hunner udviklede resistens i en sådan grad, at deres levetid faktisk oversteg den for FB-hunner, der oplevede lav konflikt (deraf minimal selektion for modstand), ser ud til at repræsentere en "overkompensation", idet de overlevede bedre end kvinder, der oplevede lav skade. Dette kan tyde på, at faktorer ud over resistensudvikling også er involveret. Mandens levetid var minimalt påvirket af seksuelle konfliktmanipulationer. Mønstret for overlevelse var i modstrid med det, der ses i betingelserne uden konfliktanalyse og blev understøttet af ændringer i kvindelig aldring under ressourcerige regimer, som viste en omvendt korrelation med niveauet af seksuel konflikt. For kvinder fra det ressourcerige regime udviklede både levetid og aldring sig således på en måde, der var i overensstemmelse med udviklingen af ​​modstand mod mandlig induceret skade (Wigby og Chapman 2004). Kvinders levetid ved kontinuerlig mandlig eksponering var også betydeligt kortere end for en gang parrede hunner, hvilket viste stærke effekter af parringsstatus på kvindens overlevelse (Reiwich og Nuzhdin 2002 Magwere et al. 2004 Liker og Szekely 2005 Maklakov et al. 2009 Barrett og Richardson 2011 et al. 2013). Selvom resultaterne tyder på, at kvindelig parringsmodstand faktisk kan have været mere udviklende under høje ressourcer, er dette ikke en formel forventning genereret fra teorien. For at understøtte denne fortolkning og udelukke muligheden for, at i det mindste en del af reaktionerne skyldes plastiske reaktioner på de øgede fødevareniveauer, ville det være meget nyttigt at påvise større additiv genetisk varians i ressourceopkøb i den høje ressourcebehandling samt estimering af behandlingseffekterne af de relevante evolutionære parametre (f.eks. genetiske varianser).

REAKTION AF EGNETHED TIL VARIATION I SEKSUEL KONFLIKT UNDER RESSOURCERIKE OG RESSOURCE-DÅRLIGE MILJØER

Vi analyserede også aldersspecifik reproduktion og fitness ved gen 13 og 30 for personer holdt under "konfliktassay"-betingelserne beskrevet ovenfor. Gen 13-dataene viste, at der i de dårlige ressourceregimer var en signifikant interaktion mellem kønsforhold og alder (LRT = 18.125, P = 0,0001) med en stejlere kurve for ES sammenlignet med højkonflikt (MB) og lavkonflikt (FB) hunner (Fig. S6A) og højere initialt antal æg ved 5 dages alderen (signifikant interaktion af kønsforhold × tid, LRT = 11.620, P = 0,0030). I modsætning hertil var ES- og FB-kurverne under det ressourcerige regime ens og stejlere end for MB-hunner (Fig. S6A) med højere initial frugtbarhed ved 5 dages alderen. En analyse af data fra dag 5 gav en signifikant interaktion (LRT = 9,5567, P = 0,0084 Fig. S6, indskud). Analyser af fitness, beregnet som den iboende stigningstakt i "r”, matchede dette mønster (fig. S7A). Aldersspecifik reproduktion (afkom) efter 30 generationer viste ingen signifikante effekter af kønsforhold (fig. S6B). Som ovenfor blev behandlingsforskelle manifesteret tidligt, hvilket gav anledning til en separat analyse af dag 8-10-data, som repræsenterede de 2 dage, der førte op til vinduet, hvor fitness realiseres under den eksperimentelle udvikling (dag 10-12). Der var dog ingen forskelle i afkom i dag 10-12-dataene, hvilket tyder på, at ethvert "underskud" hos afkom hos MB-hunner på dag 8-10 ikke blev observeret i selve dag 10-12-selektionsvinduet. Vores fortolkning er, at MB-hunner forsinker den maksimale reproduktive indsats (stejl gradient fra dag 8-10 stigende til dag 10-12 afkom), og at det er denne evne til at finjustere reproduktionsskemaet til at matche selektionsregimet, der er adaptiv. Der var ingen tilsyneladende effekt af kønsforholdsbehandling hos kvinder eller mænd med dårlige ressourcer (fig. S7B). De tidlige konditionsforskelle observeret hos kvinder fra dårlige ressourcelinjer forsvandt også af gen 30, hvilket indikerer, at omkostningerne ved eksponering for høj eller lav frekvens af parring eller frieri kan være blevet forbedret ved selektion.

Overordnet viste fitnessanalyserne, at den længere levetid hos fuldt reproduktive højkonflikt (MB) kvinder, der blev udsat for forhøjede seksuelle konflikter, var forbundet med lavere fitness i det tidlige liv, hvilket indikerer en afvejning af udviklende modstand mod mænd (Arnqvist og Rowe 2005). En sådan effekt blev ikke set hos kvinder fra regimet med dårlige ressourcer eller hos mænd fra begge ernæringsregimer. Dette fremhævede, at fitness også udviklede sig på en ressourceafhængig og kønsspecifik måde som reaktion på ændring af seksuel konflikt (Chapman 2006 Archer et al. 2012 Berg og Maklakov 2012 Archer et al. 2015). De evolutionære diætmanipulationer var både kvantitative (til kalorieniveau) og kvalitative (protein til kulhydratforhold). Begrundelsen var kraftigt at drive selektive reaktioner til det overordnede "ressourceniveau". Hvorvidt denne form for diætmanipulation i sig selv er disponeret for kønsspecifikke reaktioner er uklart, og fremtidige evolutionære diætmanipulationer kunne målrette mod denne mulighed ved at bruge mere præcist definerede diæter.


Diskussion

Seksuel selektion kan resultere i øget mandlig skade på hunner under parring (22, 29, 32), enten gennem direkte skade eller infektion med patogener, og dette burde i teorien favorisere øget kvindelig investering i immunitet, når kvindelig levetid forplantningssucces øges af øget levetid [5, 22, 23, 24, 27, 35, 39]. Her giver vi en række eksperimentelle og komparative data, der kollektivt viser, at kønsforskelle i immunitet kan moduleres af seksuel konflikt i en art, hvor omkostningerne ved parring er iøjnefaldende. Denne konklusion er baseret på observationer af (1) kønsbestemt ekspression af gener i den proPO-aktiverende kaskade (fig. 1), (2) en kvindelig skævhed i PO-aktivitet, som er væsentligt højere end hvad der er typisk hos insekter, (3) kvinde-begrænset fænotypisk plasticitet i PO-aktivitet som reaktion på parring (fig. 2), (4) kvinde-begrænsede mikroevolutionære ændringer i immunitetstræk som reaktion på eksperimentel manipulation af parringssystemet og dermed seksuel konflikt (fig. 3 og 4), og (5) korreleret udvikling mellem mandlig genital morfologi og kvindelig PO-aktivitet på tværs af arter (fig. 5).

Mens tidligere undersøgelser har kvantificeret kvindelige immunresponser efter parring [5, 22, 23, 45, 50, 53, 100, 101], er det ofte uklart, om mandlig skade via kønsorganer eller ejakulatoriske forbindelser (dvs. seksuel antagonisme) driver sådanne reaktioner, eller om de repræsenterer uafhængig kvindelig optimering af afvejningen mellem nuværende og fremtidig reproduktion [5, 22, 23, 27, 49, 102]. Her manipulerede vi direkte niveauet af seksuel selektion og konflikt, hvilket er relativt godt forstået i C. maculatus (f.eks. [47, 48, 59, 62, 103, 104, 105, 106]), og fandt et klart kvindeligt begrænset PO-respons, mens der ikke blev påvist nogen sammenhæng mellem kvindelig reproduktionsinvestering og PO-aktivitet. Derfor peger vores data på mandlige skader påført under parring som drivkraften bag kvindelige PO-investeringer. I dette system er den skade, en mand påfører sin kvindelige parringspartner, positivt korreleret til hans succes i sædkonkurrence (29), formentlig fordi sædvæskestoffer (66), der gavner mænd i sædkonkurrence (62), passerer hurtigere ind i kvindekrop, hvis kopulationskanalen er sprængt (32). Disse sår kan dog efterlade kvinder i en risiko for systemisk infektion med patogener (36), hvilket tyder på et behov for at helbrede disse skader via en PO-medieret, potentielt kostbar [68, 73, 76, 77] reaktion.

Vi antog, at disse virkninger kunne have konsekvenser for kvindens modtagelighed for infektioner, der ikke er relateret til parring, via afvejninger mellem PO-aktivitet og andre komponenter af immunitet i den proPO-aktiverende kaskade, såsom produktionen af ​​AMP'er (fig. 1a). Denne forudsigelse blev tilbudt korrelativ støtte ved observation af øget modtagelighed for bakteriel infektion hos hunner fra det polygame parringsregime (fig. 4). Vores resultater tillader os dog ikke med sikkerhed at skelne mellem flere, gensidigt inkluderende, hypoteser vedrørende det nøjagtige mekanistiske grundlag for den øgede dødelighed af polygame kvinder. Vi fandt ingen forskel i bakteriemængden mellem polygame og monogame hunner inficeret med de gram-negative bakterier P. entomophila, hvilket tyder på ingen store forskelle i evnen til at fjerne infektion og derfor heller ingen store forskelle i produktionen af ​​AMP'er, der bruges til at bekæmpe bakteriel infektion, et resultat der ikke understøtter en afvejning mellem produktionen af ​​AMP'er og PO hos polygame hunner. Resultatet fra dette eksperiment er dog næppe afgørende. En anden mulighed er, at behovet for høj PO-aktivitet i reproduktionskanalen hos polygame hunner førte til en skadelig "overaktivering" af den proPO-aktiverende kaskade ved bakteriel infektion og det samtidige behov for AMP-produktion (f.eks. [107]). Selv om en sådan overaktivering kunne maskere allokeringsafvejninger ved at deltage i det dobbelte behov for at producere PO og AMP'er, kan det faktisk have forårsaget en inflammatorisk reaktion med øget dødelighed af polygame hunner som resultat. Den proPO-aktiverende kaskade kan have skadelige immunopatologiske konsekvenser via produktionen af ​​toksiske sekundære metabolitter og skal reguleres strengt [76], og alvorlig bakteriel infektion kan dræbe organismen også via bivirkninger af overdreven melanisering [68, 73]. Fremtidige eksperimenter er nødvendige for at udpege det nøjagtige mekanistiske grundlag, der ligger til grund for vores resultater, fortrinsvis inklusive detaljerede målinger af vævsspecifikke immunitetsresponser, da vi her målte helkropsprøver.

Interessant nok led polygame kvinder øget dødelighed, når de blev inficeret med gram-positive og gram-negative bakterier, hvor forskning i Drosophila tyder på, at kun gram-positive bakterier kan aktivere immunresponser via TOLL, mens gram-negative bakterier menes at fremkalde immunresponser hovedsageligt via Imd pathway [78], som ikke har en klar forbindelse til den proPO-aktiverende kaskade. Dette resultat kan således tale imod immunitetsafvejninger mellem komponenter i proPO-aktiveringskaskaden som en generel mekanisme, der forklarer den observerede differentielle dødelighed mellem polygame og monogame kvinder. Imidlertid har adskillige undersøgelser på hvirvelløse dyr nu vist krydstale mellem TOLL- og Imd-vejen ([55, 78, 108,109,110]), og at proPO-kaskaden let kan aktiveres af gramnegative bakterier [74, 110, 111]. Faktisk har TOLL endda været direkte impliceret i at regulere seksuel dimorfi i immunitet over for gram-negative bakterier i Drosophila melanogaster [112], hvilket tyder på, at den konsekvente forskel i dødelighed af monogame og polygame kvinder inficeret med gram-positive B. thuringiensis og gram-negative P. entomophila kan stadig være forankret i differentiel brug af den proPO-aktiverende kaskade.

Mandens reproduktionssucces i polyandrøse parringssystemer maksimeres typisk af et skift mod aktuel reproduktion hos den kvindelige parringspartner, da dette ville øge sandsynligheden for, at hannen får en større del af afkommet produceret af hunnen [5, 16, 23, 24 , 44]. Disse ideer forudsiger, at hanner bør udvikle sig til at manipulere hunner til at investere i nuværende reproduktion på bekostning af nedsat immunitet og lang levetid [22, 23]. I overensstemmelse med disse forudsigelser får hanner med længere kønsrygge, der forvolder mere skade under parringen, flere afkom i C. maculatus [59, 62] og synes at stimulere kvindelig frugtbarhed (upublicerede data). Desuden regulerer det mandlige ejakulat kvindelig immunitet efter parring Drosophila, guppyer, mus og mennesker [44, 45, 51, 52, 113, 114], selvom det ofte er uklart, i hvilket omfang virkningerne er skadelige eller gavnlige for hunnen generelt [5, 22, 23, 27, 115]. Det er endda blevet foreslået, at mænd kan opnå fitnessfordele ved at overføre seksuelt overførte sygdomme, der udløser skift i kvindelig allokering mod nuværende reproduktion [21, 116], men denne mulighed mangler empirisk støtte [117]. Hos andre insekter øger eller mindsker kvindens PO enten efter parring, og det er blevet foreslået, at hos arter, hvor parring nedregulerer kvindens PO-aktivitet, ødelægger hannerne den kvindelige immunfunktion [23]. Selvom vores resultater ikke afkræfter denne hypotese, er de også i overensstemmelse med C. maculatus hunner bliver "primet" til skadelig parring, og at PO-aktivitet hos hunner i starten falder efter parring som følge af sårheling, men genoprettes derefter hurtigt. En sådan kvindelig anticipatorisk immunitetsaktivering er blevet observeret i Drosophila [118, 119] og væggelus [120].


Rett syndrom: en neurologisk lidelse med metaboliske komponenter

Rett syndrom (RTT) er en neurologisk lidelse forårsaget af mutationer i det X-bundne gen methyl-CpG-bindende protein 2 (MECP2), en allestedsnærværende udtrykt transkriptionel regulator. På trods af bemærkelsesværdige videnskabelige fremskridt siden dens opdagelse, mekanismen, hvorved MECP2 mutationer forårsager RTT-symptomer er stort set ukendt. Derfor er behandlingsmulighederne for patienter i øjeblikket begrænsede og centreret om symptomlindring. Menes at være en fuldstændig neurologisk lidelse, har RTT-forskning fokuseret på rollen som MECP2 i centralnervesystemet. Imidlertid er mangfoldigheden af ​​fænotyper identificeret i Mecp2 mutante musemodeller og RTT-patienter implicerer vigtige roller for MeCP2 i perifere systemer. Her gennemgår vi historien om RTT og fremhæver gennembrud på området, der har ført os til i dag. Vi udforsker de nuværende beviser, der understøtter metabolisk dysfunktion som en komponent i RTT, og præsenterer nyere undersøgelser, der har afsløret forstyrret lipidmetabolisme i hjernen og perifere væv hos musemodeller og patienter. Sådanne fund kan have en indvirkning på livskvaliteten for RTT-patienter, da både diæt- og lægemiddelintervention kan ændre lipidmetabolismen. I sidste ende konkluderer vi, at et grundigt kendskab til MeCP2's forskellige funktionelle mål i hjernen og kroppen vil være påkrævet for at behandle dette komplekse syndrom.

1. Rett syndrom: kliniske træk og stadier

Rett syndrom (RTT, OMIM #312750) blev først beskrevet af Andreas Rett, en østrigsk pædiatrisk neurolog, efter at have observeret to kvindelige patienter med identiske håndvridende stereotyper i hans kliniks venteværelse. Ved undersøgelse fandt han ud af, at begge patienter havde samme historie: normal tidlig udvikling, efterfulgt af en periode med regression og tab af målrettede håndbevægelser. Dr. Rett, fascineret, dokumenterede andre kvindelige patienter i sin klinik med lignende symptomer. Da han troede, at symptomerne var i overensstemmelse med en metabolisk lidelse, kaldte han det 'cerebroatrofisk hyperammonæmi' i en tysk publikation fra 1966 [1]. Imidlertid opnåede lidelsen ikke generel accept blandt det medicinske samfund, før dens beskrivelse i engelske publikationer 17 år senere [2]. RTT er nu velkendt som en fremadskridende neurologisk lidelse, der primært rammer piger, som forekommer i 1:10 000-15 000 levende kvindefødsler [3].

Den kliniske diagnose af RTT er baseret på et batteri af sameksisterende og veldefinerede inkluderende og eksklusive kriterier (opsummeret i [4-6]). Efter en periode med normal neurologisk og fysisk udvikling i løbet af de første 6-18 måneder af livet, begynder de første træk ved RTT at manifestere sig i den tidlige barndom og vises gradvist over flere stadier (figur 1): stagnation (alder 6-18 måneder), hurtig regression (alder 1-4 år), pseudostationær (alder 2-potentielt liv) og sen motorisk forringelse (alder 10-liv). Karakteristiske symptomer på RTT omfatter tab af erhvervede tale- og motoriske færdigheder, gentagne håndbevægelser, vejrtrækningsuregelmæssigheder og anfald. RTT-patienter kan også lide af sporadiske episoder med gastrointestinale problemer, hypoplasi, tidligt indsættende osteoporose, bruxisme og skrigende besværgelser [4]. På trods af disse svækkelser er RTT-patienter godt integreret i deres familier og nyder personlig kontakt [7]. Udviklingen af ​​nye forstærkende kommunikationsteknologier har givet ellers ikke-verbale RTT-patienter mulighed for at engagere sig med andre og udtrykke sig [8].

Figur 1. Tidslinje for stadier og symptomdebut hos RTT-patienter. Rett syndrom (RTT) er opdelt i fire progressive stadier. Patienter viser tilsyneladende normal tidlig udvikling. Mellem 6 og 18 måneders alderen oplever patienterne en periode med udviklingsstagnation (stadie I) og opfylder ikke længere deres mentale, kognitive eller motoriske milepæle. Væksten i hovedomkredsen aftager, og denne periode varer i uger til måneder. Fase II er defineret ved hurtig udviklingsregression, hvor erhvervede målrettede håndbevægelser og verbale færdigheder går tabt. Mikrocefali forværres, og vejrtrækningsuregelmæssigheder og/eller anfald opstår. Fase III er en pseudo-stationær plateauperiode, hvor patienter kan vise mild bedring i kognitive interesser, men målrettede hånd- og kropsbevægelser forbliver alvorligt formindsket. Fase IV er defineret af motorisk forringelse og kan vare årtier. Mange patienter er kørestols- og/eller gastrostomi-sondeafhængige. Det er dog ikke alle piger, der går videre til dette alvorlige stadium.

Mange børn diagnosticeret med RTT har reduceret hjernevolumen sammenlignet med raske individer, hvilket stemmer overens med en mindre hovedomkreds [9,10]. Reduceret hjernevolumen skyldes i høj grad lille neuronal kropsstørrelse og en tættere pakning af celler, især i lag III og V i hjernebarken, thalamus, substantia nigra, basalganglier, amygdala, cerebellum og hippocampus [11]. Patienter har også reduceret dendritisk arborisering, hvilket indikerer en forsinkelse i neuronal modning [12]. Ydermere tyder hypopigmentering af substantia nigra på en dysfunktion af dopaminerge neuroner [9]. RTT-patienter viser tegn på dysregulerede neurotransmittere, neuromodulatorer og transportører, hvilket indikerer en vigtig rolle i synaptisk funktion [13,14].

Metaboliske komplikationer er også almindelige ved RTT.En række patienter har dyslipidæmi [15,16], forhøjet plasmaleptin og adiponectin [17,18], forhøjet ammoniak [1] og betændelse i galdeblæren, et organ som lagrer galde til fedtfordøjelse [19]. Ændringer i hjernens kulhydratmetabolisme [20] og neurometabolitter forbundet med celleintegritet og membranomsætning [21,22] er også blevet rapporteret. Derudover har energiproducerende mitokondrier unormal struktur i patientceller [23-26]. Konsekvent er ændret elektrontransportkædekompleksfunktion [27], øget oxidativt stress [28-30] og forhøjede niveauer af lactat og pyruvat i blod og cerebrospinalvæske [20,27] blevet observeret hos RTT-patienter (gennemgået i [31] ).

Behandling af RTT-patienter er i øjeblikket begrænset til symptomkontrol. Med tilstrækkelig opmærksomhed på ortopædiske komplikationer, kontrol med anfald og ernæring, kan kvinder med RTT overleve til middelalderen og ældre. Patienter har dog en pludselig og uventet dødsrate på 26%, meget højere end raske personer i en tilsvarende alder, og dør typisk på grund af luftvejsinfektion, hjerteinstabilitet og respirationssvigt [32-34].

2. Mutationer i MECP2 forårsage Rett syndrom

Familietilfælde var medvirkende til at bestemme den genetiske årsag til typisk RTT. Multipoint-koblingsanalyse af en brasiliansk RTT-familie med tre berørte og tre upåvirkede døtre indsnævrede placeringen af ​​genet til Xq28 [35]. Efter dette gennembrud i 1999, Amir et al. [36] analyserede systematisk næsten 100 kandidatgener lokaliseret i Xq28-regionen for mutationer i RTT-patienter. Ved at screene genomisk DNA fra sporadiske og familiære RTT-patienter identificerede gruppen skadelige missense-, frameshift- og nonsens-mutationer i den kodende region af genet methyl-CpG-bindende protein 2 (MECP2) hos syv patienter. Det er nu veletableret, at mutationer i MECP2 tegner sig for 95 % af typiske RTT-tilfælde og forekommer ofte de novo [36-38]. RTT-patienter er heterozygote for MECP2 mutation, der bærer en normal og en muteret kopi af MECP2. Når et barn har RTT-lignende symptomer, men ikke opfylder alle diagnostiske kriterier for RTT, kan det blive diagnosticeret med atypisk RTT, hvor symptomer afviger i debutalder, rækkefølge af klinisk profil og/eller sværhedsgrad (tabel 1) [39-49]. Mange atypiske tilfælde er forbundet med mutationer i X-bundet cyclin-afhængig kinase-lignende 5 (CDKL5 OMIM #300203) eller gaffelkasse G1 (FOXG1 OMIM #164874), men nogle forbliver udefinerede [39-49]. Mutationer i MECP2 har også været forbundet med intellektuelle handicap, autisme og lupus erythematosis [50,51].

Tabel 1. Atypiske Rett syndrom varianter. Disse varianter kan være mildere eller mere alvorlige end klassiske RTT-symptomer.

MeCP2 er et rigeligt nukleart protein, der oprindeligt blev identificeret i en screening for proteiner med methyl-DNA-specifik bindingsaktivitet. Det er allestedsnærværende udtrykt i alle menneskelige væv, men er særligt rigeligt inden for neuroner [52,53]. I centralnervesystemet (CNS) udtrykkes MeCP2 i lave niveauer prænatalt, men stiger progressivt under neuronal modning og synaptogenese når sit højdepunkt i modne, post-migratoriske neuroner, hvilket tyder på en rolle for MeCP2 i opretholdelse af neuronal modning, aktivitet og plasticitet [ 54-57].

MECP2 er kodet af fire exoner, der er udtrykt som MeCP2_exon1 (e1) og MeCP2_exon2 (e2) isoformerne (figur 2)-en) [57-59]. MeCP2_e1 er 10 gange mere udbredt end MeCP2_e2 i menneske- og musehjerne og i musebryssel og lunge, hvorimod et 1:1-forhold ses i musetestis og -lever [60,61], hvilket tyder på, at e1 er den primære funktionelle isoform i hjernen . Exon 4 i både mus og mennesker indeholder en 8,5 kb 3'UTR, som er en af ​​de længste kendte i det menneskelige genom, og har fire polyadenyleringssteder (polyA), hvilket resulterer i fire differentielt udtrykte transkripter (figur 2)-en) [62-64]. 3'UTR kan regulere nedstrøms oversættelse af MECP2's transkript ved at kontrollere mRNA-nedbrydning og stabilitet, nukleocytoplasmatisk transport, mRNA-lokalisering og modulering af translation [65]. Suppleanten MECP2 transkripter viser kvantitative forskelle i ekspression i forskellige væv, i forskellige stadier af museembryonal udvikling og i human postnatal hjerneudvikling [62].

Figur 2. Mutationer i det multifunktionelle protein MeCP2 forårsager RTT. Farvede bokse angiver forskellige kodede funktionelle domæner: lys orange, N-terminal af MeCP2_e1 mørk orange, N-terminal af MeCP2_e2 grøn, N-terminal domæne (NTD), som har identiske aminosyresekvenser mellem de to isoformer pink, methylbindende domæne ( MBD) blå, transkriptionelt repressionsdomæne (TRD) rød, nuklear coreceptor co-repressor (NCoR) interaktionsdomæne (NID) gul, C-terminalt domæne (CTD). (-en) De fire exoner i MECP2 gen. Pile i exon 1 og 2 angiver 'ATG'-startkodonerne for henholdsvis MeCP2_e1 eller MeCP2_e2. Pile i 3′ UTR angiver flere polyA-steder, hvilket resulterer i transkripter af forskellig længde. Stiplede linjer på toppen angiver splejsningsmønsteret af MeCP2_e1 og stiplede linjer i bunden angiver splejsningsmønsteret af MeCP2_e2. (b) Funktionelle domæner og post-translationelle modifikationer (PTM'er) af MeCP2. Koordinater er i forhold til isoform MeCP2_e2. MeCP2 indeholder to PEST-domæner (sorte skærefelter), to HMG-domæner (blå skærefelter), tre AT-hook-domæner (sorte solide bokse), et funktionelt nuklear lokaliseringssignal (NLS) (lyserød skæret felt) og et WW-domæne (orange skåret kasse). PTM'er er spredt ud over proteinet og regulerer interaktioner med MeCP2-bindingspartnere. (c) Almindelig skade MECP2 mutationer. Skematisk af MeCP2 med funktionelle domæner. y-akse repræsenterer procentdelen af ​​RTT-patienter med indiceret mutation. Missense-mutationer er i lilla og nonsens-mutationer er i rødt. Tilsammen udgør disse punktmutationer cirka 70 % af alle RTT-forårsagende mutationer.

MeCP2 består af fire primære funktionelle domæner (figur 2b). Bindingsspecificiteten af ​​MeCP2 er afhængig af tilstedeværelsen af ​​methyleret DNA og dets methylbindende domæne (MBD) placeret ved aminosyrerne 78-162 [53,66]. MeCP2 er forskellig fra andre methyl-DNA-bindende proteiner på grund af dets evne til at interagere med et enkelt, symmetrisk methyleret CpG (mCpG) sted [53,66]. Dog nyere værk af Lagger et al. afslørede, at MeCP2 også har en høj bindingsaffinitet for methyleret og hydroxymethyleret CAC (henholdsvis mCAC og hmCAC) i neuroner, hvilket viser, at både methylerede dinukleotider og trinukleotider kan rekruttere MeCP2 til DNA til transkriptionel regulering [67]. Et transkriptionelt repressordomæne (TRD) forekommer i aminosyrerne 207-310 og indeholder NCoR-interaktionsdomænet (NID), som letter binding af MeCP2 til NCoR1/SMRT co-repressorkomplekset [68-71]. Det C-terminale domæne (CTD) viser også DNA-bindingsevne, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​et kromatin-interagerende domæne i nærheden af ​​5'-regionen af ​​CTD'en [72].

CpG-methylering er minimal i hvirvelløse genomer (10-40%), men meget høje i hvirveldyrgenomer (60-90%) [73,74]. Methylerede DNA-steder rekrutterer methyl-DNA-bindende proteiner som MeCP2, som tiltrækker transkriptionelle regulatoriske komplekser [75]. Konsekvent undertrykker MeCP2 transkription på en genspecifik måde og interagerer med co-repressorkomplekserne mSIN3A og NCoR1/SMRT [70,76]. Men MeCP2 kan også lette transkriptionel aktivering [77], kromatinkomprimering [78,79] og mRNA-splejsning [80,81], mens den også interagerer med en lang række andre regulatoriske proteiner involveret i en række molekylære veje [81-84] .

På trods af at have veldefinerede funktionelle domæner, klassificeres MeCP2 som et iboende forstyrret protein (IDP) og erhverver tertiær struktur ved interaktion med andre proteinpartnere eller nukleinsyrer [85]. Uordnet struktur gør IDP'er notorisk promiskuøse bindingspartnere [86]. Som sådan tilføjer post-translationelle modifikationer (PTM'er) et ekstra lag af regulering for at sikre MeCP2-binding til passende partnere. Følgelig gennemgår MeCP2 mange PTM'er, herunder acetylering, phosphorylering, ubiquitinering og SUMOylering (figur 2)b gennemgået i [87,88]), som stærkt regulerer interaktioner. Alt i alt tyder flere undersøgelser på, at gener kan aktiveres eller undertrykkes af MeCP2, afhængigt af den cellulære kontekst [77,89,90], hvilket tyder på, at MeCP2 kan defineres som en transkriptionel modulator.

3. Fænotypevariation blandt mennesker med MECP2 mutationer

Ifølge Human Gene Mutation-databasen er 555 RTT-forårsagede mutationer blevet identificeret i MECP2 [91]. De novo mutationer tegner sig for 99,5% af mutationerne i MECP2, hvoraf ca. 70 % er C > T-overgange, som typisk opstår på grund af hypermutabilitet ved mCpG-dinukleotider i MECP2 sted [48]. I modsætning til X-kromosomet i oocytter er X-kromosomet i sædceller hypermethyleret. Det er blevet spekuleret i, at spontan deaminering af methylerede cytosinrester kan resultere i en overgang til en thymin, hvilket øger potentialet for skadelige mutationer ved hypermethylerede CpG-steder [92,93]. Som sådan er de fleste de novo MECP2 mutationer stammer fra det paternalt nedarvede X-kromosom [94].

Det brede spektrum af MECP2 mutationer omfatter punktmutationer, insertioner, duplikationer, små eller store deletioner eller hele MECP2 gensletninger. På trods af dette tegner kun otte missense- og nonsens-mutationer (R106 W, R133C, T158M, R168X, R255X, R270X, R294X og R306C) sig for cirka 70 % af alle mutationer i RTT (figur 2)c). C-terminale deletioner udgør yderligere cirka 8 %, og store deletioner udgør cirka 5 % [38]. Mutationstyper har tendens til at klynge sig: missense-mutationer forekommer hyppigt i MBD, mens nonsens-mutationer generelt forekommer nedstrøms for MBD [38]. Frameshift-mutationer som følge af små deletioner forekommer normalt i C-terminalen (figur 2c) [48]. Placeringen af ​​mutationen reducerer specifikke aspekter af MeCP2-funktionen [95]. For eksempel reducerer mutationer placeret i MBD'en MeCP2's DNA-bindingsevne.

I tidlige studier, Hagberg et al. [2] bemærkede, at sværhedsgraden af ​​motorisk svækkelse hos klassiske kvindelige RTT-patienter varierede fra kørestolsbundet før 5 års alderen til at bevare evnen til at gå med en Parkinson-lignende gang. I betragtning af den brede vifte af mutationstyper og fænotype sværhedsgrad, har genotype-fænotype undersøgelser korreleret mutationsstatus med kliniske træk hos RTT-patienter [38]. Tidlige trunkerende mutationer i MECP2 gen såsom R168X, R255X og R270X, og store INDEL'er, forårsager den mest alvorlige fænotype. Missense-mutationer såsom R133C og R306C, sene trunkerende mutationer som dem i R294X og andre i 3'-enden, som holder MBD og det meste af TRD intakt, er de mildeste [38,96]. Derfor, MECP2 mutationsstatus er en stærk prædiktor for sygdommens sværhedsgrad, men fænotypevariation forekommer almindeligvis mellem individer med samme MECP2 mutation og tilskrives forskelle i X-kromosominaktivering (XCI) [97].

Kvindelige heterozygote RTT-patienter er mosaik, hvilket tillader nogle celler at udtrykke mutanten MECP2, mens de andre udtrykker vildtype-allelen. XCI kan fortrinsvis være skæv, så det mutante X-kromosom er mere eller mindre udtrykt end vildtypen, hvilket resulterer i henholdsvis en relativt mere alvorlig eller mildere præsentation af RTT [98,99]. Moderen til børnene i den oprindelige brasilianske familie viste ingen symptomer, fordi hendes X-inaktiveringsfodaftryk skævede 95 % af udtrykket fra det ikke-muterede kromosom [35]. Interessant nok kan flere patienter med den samme mutation udvise et bredt spektrum af klinisk sværhedsgrad på trods af lignende mønstre af XCI i perifert blod, potentielt på grund af andet genmutationer (modifikatorer), der lindrer eller forbedrer det fænotypiske resultat af MECP2 mutation [100].

Som en X-bundet lidelse blev RTT anset for at være dødelig hos mænd. Men mænd med kliniske træk, der ligner klassisk RTT, blev rapporteret selv før opdagelsen af ​​det kausale gen. I 1999, Wan et al. [37] beskrev den første mutation i MECP2 hos en mandlig patient, der døde som etårig af medfødt neonatal encefalopati. Denne opdagelse førte til, at drenge blev inkluderet i screeningen for MECP2 mutationer, hvilket gør det muligt at klassificere dem i fire kategorier: alvorlig neonatal encefalopati og infantil død, typisk RTT, mindre alvorlige neuropsykiatriske fænotyper eller MECP2 duplikationssyndrom (tabel 2) [101-108].

Tabel 2. Hanner med MECP2 mutationer falder i fire kategorier.

4. Dyremodeller informerer MECP2 fungere

MECP2 optræder på tværs af hvirveldyrs evolution med stærk bevarelse i dets funktionelle domæner. Drosophila besidder ikke en ortolog til menneske MECP2, måske fordi det hvirvelløse genom er sparsomt methyleret [109]. I 2013, Pietri et al. isoleret den første nul mecp2 Q63*/Q63* zebrafisk model, som ikke rekapitulerer træk ved den menneskelige lidelse [110,111]. I stedet er fiskene levedygtige og formerer sig normalt, men viser mindre motoriske abnormiteter og en forkortet levetid, muligvis på grund af immundefekter [112]. I 2017, Chen et al. [113] offentliggjorde den første analyse af MECP2-mutante cynomolgus-aber, som udviser nedsat bevægelse, social tilbagetrækning, øget stereotyp adfærd og søvnabnormiteter - symptomer almindelige hos RTT-patienter [113]. Samlet set udviser aberne CNS- og transkriptomændringer, der er i overensstemmelse med mennesket, på trods af at de er genetisk heterogene [113]. Derfor kan simian-modeller tjene som et robust, omend dyrt, system til at studere sofistikerede funktioner i RTT i fremtiden.

Mecp2 mutante gnavere rekapitulerer mange kendetegnende symptomer på RTT og er det mest almindeligt accepterede værktøj til at studere lidelsen. En konstrueret nulrottemodel af RTT (Mecp2 ZFN ) viser fænotypiske og transkriptomiske ligheder med musemodeller [114-116]. Selvom rotter ville have fordele til fysiologisk og præklinisk testning, bruges de ikke i vid udstrækning, måske på grund af deres omkostninger og manglen på genetiske værktøjer. I stedet er to nul-muse-alleler de primære modeller for Retts syndrom (tabel 3). Fuglelaboratoriet udviklede en Mecp2 mutant musemodel ved konstruktion røget laksP-steder flankerer Mecp2 exoner 3 og 4 for at skabe en 'flokset' betinget linje [117]. Denne betinget klar allel, kaldet Mecp2 tm1Bird , er hypomorfisk, hvilket resulterer i milde RTT-lignende symptomer på grund af en 50 % reduktion i MeCP2-ekspression [118,119]. En nul muselinje, der manglede noget proteinprodukt, blev skabt ved at krydse med en kimlinjesletende Cre-driver (Mecp2 tm1.1Bird /Y) [117]. Samtidig designede Jaenisch laboratoriet en Mecp2 mutant mus ved konstruktion røget laksP-steder, der flankerer exon 3, Mecp2 tm1.1Jae [120]. En mindre Mecp2 transkript og proteinfragmenter er til stede i mutant hjerne, men disse mus viser fænotyper svarende til null Bird-allelen.

Tabel 3. Mecp2 mutante musemodeller. Det Mecp2 tm1.1Bird og Mecp2 tm1.1Jae alleler er de mest almindeligt undersøgte. Punktmutationsalleler er designet til at efterligne humane RTT-fremkaldende mutationer. Mange betingede sletninger er blevet oprettet, men er ikke opsummeret her.

a Noget proteinprodukt bevaret.

Selvom RTT overvejende påvirker piger, finder langt de fleste publicerede museundersøgelser sted i hemizygote Mecp2 mutante hanmus, fordi de har en mere konsistent fænotype tidligt i livet. Mens kvinde Mecp2 mutante mus er mere klinisk relevante, tilfældig XCI hos gnaverhunner forårsager skævvridning af genekspression, hvilket resulterer i store variationer i fænotypepræsentation, hvilket gør det vanskeligt at adskille, hvilke fænotyper der opstår gennem celleautonome versus ikke-autonome veje [121]. De mest brugte mandlige musemodeller, Mecp2 tm1.1Bird og Mecp2 tm1.1Jae , udviser konsekvent åbenlyse fænotyper i alderen fire til seks uger og dør mellem 8 og 12 uger gamle [117.120]. Selvom Mecp2 null-mus er asymptomatiske før fire ugers alderen, der er subtile, men konsistente defekter i transkription, ionotropisk receptorsignalering og neuronal respons under sen embryogenese og den perinatale periode [122-124]. Ved fire ugers alderen begynder nullmus at udvikle ukoordineret gang, hypoaktivitet, rystelser, klemning af bagben, der minder om håndstereotypier set hos RTT-patienter, og uregelmæssig vejrtrækning. Disse fænotyper udvikler sig i sværhedsgrad indtil døden. Soma og kerner af Mecp2 mutante neuroner i hippocampus, cerebral cortex og cerebellum er mindre og tættere pakket end hos vildtype-kuldkammerater, hvilket sandsynligvis giver anledning til en mindre hjerne [120].

Mærkeligt nok, kropsvægt ind Mecp2 null-mus adskiller sig afhængigt af hankøns genetiske baggrund Mecp2 tm1.1Bird /Y-mus på en C57BL/6J-baggrund er væsentligt undervægtige i fire ugers alderen sammenlignet med vildtype-kuldkammerater. På en 129S6/SvEvTac-stamme viser hanner en omvendt effekt: Mecp2 tm1.1Bird /Y-mus har samme vægt som vildtype-kuldkammerater indtil otte ugers alderen, hvor de bliver væsentligt tungere end søskende [117]. Til sidst, Mecp2 tm1.1Bird /Y-mus på CD1-baggrund vejer lidt mindre end vildtype tidligt i livet, men når en normalvægt i alderen seks til syv uger [125].

Heterozygote hunmus viser heller ingen symptomer i starten, men bliver hypoaktive og begynder at spænde bagben efter tre måneder. Ved ni måneders alderen udvikler ca. 50 % af heterozygote kvinder de samme fænotyper som deres null-modstykker, men nogle kvinder forbliver asymptomatiske efter 1 år. Derfor har hunner en levetid, der giver mulighed for reproduktion, hvilket tyder på, at den heterozygote tilstand kan udvise langsigtet stabilitet, som det ses i RTT [117]. Interessant nok bliver heterozygote hunmus på alle genetiske baggrunde, såvel som hunrotter, betydeligt overvægtige, når de ældes [115.117.125], selvom mennesker med RTT har et bredt spektrum i kropsmasseindeks [15].

Ud over deletionsmusemodeller er adskillige alleler blevet konstrueret til at rekapitulere klinisk relevante og almindelige MECP2 mutationer hos menneskelige patienter. Mus med disse alleler har en tendens til at vise mildere og senere indsættende neurologiske fænotyper sammenlignet med Mecp2 tm1.1Bird nul-allel, og de fleste rekapitulerer ikke hele sygdomsfænotypen (opsummeret i tabel 3) [70,71,126-138]. I et forsøg på at skelne årsagen til specifikke fænotyper, Mecp2 er også blevet betinget slettet fra forskellige celletyper og væv [139-142].En række betingede deletioner i forskellige undergrupper af neuroner fremhæver den væsentlige rolle af MeCP2 i neuronal funktion, men deres mildere præsentation antyder yderligere roller uden for CNS (gennemgået i [143]).

RTT-patienter viser abnorm neuronal morfologi, men ikke neuronal død, hvilket giver legitimitet til muligheden for, at defekte MeCP2-deficiente celler kan komme sig [144]. I en skelsættende undersøgelse, Guy et al. opnået symptomvending i Mecp2 mutante mus efter indtræden af ​​motorisk dysfunktion og neurologiske underskud. Det Mecp2 tm2BirdFloxedStop' allel, hvor en røget laksP-STOP-Neo-røget laksP-kassette blev indsat i intronen opstrøms for endogen Mecp2 exon 3, blev krydset med mus, der bar en Cre-rekombinase fusioneret til østrogenreceptoren (OR). Injektion af tamoxifen (TM) fik Cre-ER til at translokere til kernen og slette FloxedStop-kassetten for at genaktivere Mecp2 gen [145]. FloxedStop/Y hanmus opførte sig som Mecp2 tm1.1Bird /Y-mus udviklede RTT-lignende symptomer mellem fire og seks uger gamle og overlevede i cirka 10 uger i gennemsnit. TM-injektioner i mus med fremskredne neurologiske symptomer og vejrtrækningsforstyrrelser genoprettet Mecp2 ekspression til 80 % af vildtypeniveauer. Det er bemærkelsesværdigt, at genoprettelse af MeCP2-ekspression vendte symptomerne: neurologiske vurderinger og det generelle helbred blev forbedret, og 80 % af TM-behandlede dyr overlevede efter 30 ugers alderen (slut af undersøgelsen). Tilsvarende symptomatisk FloxedStop/+ heterozygote hunmus viste signifikant symptomforbedring ved TM-injektion, herunder en reduktion i kropsvægt [145]. Dette afgørende fund viste, at udviklingsmæssigt fravær af MeCP2 ikke irreversibelt beskadiger neuroner, hvilket indgyder håb om, at symptomvending er mulig hos RTT-patienter.

5. MeCP2 modulerer transkription ved at bygge bro mellem DNA og regulatoriske komplekser

I 2001, Kokura et al. [83] viste først, at MeCP2 binder til NCoR1/SMRT co-repressorkomplekset. NCoR1 og SMRT er meget homologe proteiner, der rekrutteres til kromatin for at undertrykke transkription ved at fungere som et stilladsprotein for andre nukleare receptorer, DNA-bindende proteiner og histon-deacetylaser [146]. En rolle for NCoR1/SMRT-komplekset er at rekruttere histon-deacetylase 3 (HDAC3) til DNA, som fjerner histonacetylmærker, hvilket resulterer i en lukket kromatintilstand [147,148]. Andre medlemmer af dette kompleks inkluderer G-protein pathway suppressor 2 (GPS2), transducin beta-like 1 (TBL1) og transducin beta-like 1-relateret (TBLR1) [149]. Interaktionen mellem MeCP2 og NCoR1/SMRT-komplekset blev genundersøgt over et årti senere, da Lyst et al. [70] søgte at identificere bindingspartnere til MeCP2. MeCP2-protein blev oprenset fra hjernen på reportermus med et forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) indsat i 3' UTR af Mecp2 gen (Mecp2 tm3.1Bird ) og massespektrometri blev brugt til at identificere associerede proteiner. Bemærkelsesværdigt var fem af de syv identificerede MeCP2-proteininteraktorer underenheder af NCoR1/SMRT co-repressorkomplekset [70]. Desuden fandt denne gruppe, at interaktionen mellem MeCP2 og NCoR1/SMRT-komplekset blev lettet af NCoR1/SMRT-interaktionsdomænet (NID) placeret ved MeCP2-aminosyrerne 285-309 [70,71]. MeCP2 binder til komplekse medlemmer TBL1 og TBLR1 ved disse rester via et WD40-domæne, i modsætning til andre NCoR1/SMRT-rekrutterere, der interagerer med NCoR1/SMRT-stilladsproteinerne direkte [150]. Disse resultater har ført til en model, hvor MeCP2 fungerer som en bro mellem methyleret DNA og corepressorkomplekset, der forankrer NCoR1/SMRT-komplekset til DNA via henholdsvis dets NID og MBD. Det antages, at afbrydelse af denne bro fører til histonhyperacetylering og en åben kromatintilstand, hvorved transskriptionen af ​​målgener øges (figur 3). Alligevel studerer transkriptionel profilering ved hjælp af hele hjernen Mecp2/Y-mus har ikke afsløret dramatiske genekspressionsændringer [151.152], måske fordi hjernens meget heterogene natur maskerer betydelige forstyrrelser i subpopulationer af celler.

Figur 3. MeCP2 forankrer NCoR/SMRT til methyleret DNA. I raske celler binder MeCP2 methylerede CpG-dinukleotider (orange cirkler) og rekrutterer NCoR1/SMRT-HDAC3 co-repressorkomplekset til regulatoriske steder, der omgiver målloci. HDAC3 fjerner acetyleringsmærker fra omgivende histoner for at komprimere kromatin og forhindre transkription af målgener. I Mecp2 mutantceller, kan NCOR1/SMRT-HDAC3-komplekset ikke binde til methyleret DNA, hvilket resulterer i en åben kromatintilstand og øget transskription af gener. Kendte målgener for komplekset i leveren omfatter SQL og andre lipogeneseenzymer. Mål i hjernen forbliver ukendte.

RTT-forårsagende missense-mutationer klynges i MBD og NID, hvilket fremhæver vigtigheden af ​​disse to regioner i MECP2 i RTT-patologi [153]. Inden for NID er et mutationshotspot af MeCP2 mellem aminosyre 302 og 306 [70.154]. R306C er en af ​​de mere almindelige RTT-mutationer, og denne allel blev modelleret i mus for at bestemme den biologiske relevans af NCoR1-corepressorkomplekset i RTT (tabel 3) [68]. Ved seks ugers alder, mand Mecp2 R306C mus udvikler rystelser, hypoaktivitet, klemning af bagben og defekter i motorisk aktivitet. Halvtreds procent af Mecp2 R306 mus overlever ikke efter 18 ugers alderen og dør alle inden for 25 uger [70]. R306C-mutanten MeCP2 har en intakt MBD, som binder til methyleret heterochromatin. Mutationen deaktiverer imidlertid NID, hvilket forhindrer MeCP2 i at binde TBL1 eller TBLR1, og dermed komplekset, der indeholder NCoR1 og HDAC3, hvilket forstyrrer MeCP2-medieret transkriptionel undertrykkelse. Dette tyder på, at afbrydelsen af ​​MeCP2-NCoR1/SMRT komplekse interaktion alene er i stand til at forårsage RTT-lignende fænotyper.

For at teste MeCP2-NCoR/SMRT1-interaktionens primære rolle blev effekten af ​​et radikalt trunkeret MeCP2-protein undersøgt for symptomvending hos mus [155]. Mus blev genereret, der udtrykte et MeCP2-protein, der kun bestod af MBD-, NID- og korte linker-regionerne, mens alle andre aminosyresekvenser af MeCP2 blev fjernet. Bemærkelsesværdigt udvikler mus, der udtrykker dette trunkerede protein, kun milde RTT-lignende symptomer og har en normal levetid. Derudover forhindrer eller lindrer genetisk reaktivering eller virus-medieret levering af dette minimale MeCP2-protein symptomer i Mecp2-henholdsvis mangelfulde præsymptomatiske eller postsymptomatiske mus. Dette tyder på, at en meget vigtig rolle for MeCP2 er at forbinde DNA til NCoR1/SMRT-komplekset.

6. En musemutageneseskærm forbinder MeCP2 med lipidmetabolisme

Mens Mecp2 mutante mus er en fremragende model for RTT, eliminering af MeCP2 påvirker ekspressionen af ​​et stort antal veje i CNS, hvilket gør det vanskeligt at udpege, hvilke der spiller en nøglerolle i patologi [77,89,90]. Af denne grund, Buchovecky et al. [156] brugte en upartisk fremadrettet genetisk suppressor-skærm i Mecp2 null-mus for at identificere mutationer, der lindrer RTT-symptomer, som kunne udnyttes som potentielle behandlingsmål. Genetisk screening er et kraftfuldt værktøj til at opdage stier involveret i sygdomsætiologi uafhængigt af a priori antagelser. Mærkeligt nok blev der fundet en dominerende nonsensmutation i squalenepoxidase (SQL), et monooxygenase- og hastighedsbegrænsende kolesterolbiosynteseenzym, som kræver en elektrondonor fra mitokondrier for dets funktion [157]. Denne mutation i SQL forbedrede RTT-lignende motoriske fænotyper, overordnet helbred og levetid i Mecp2 null hanmus [156]. Dette udløste spørgsmålet: er kolesterolmetabolismen forstyrret Mecp2 mutante mus?

Kolesterol er en grundlæggende bestanddel af alle celler [158,159]. Mens leveren er den primære producent af kolesterol til kroppen, er kolesterol også en vigtig komponent i hjernen, hvor det fungerer i membranhandel, signaltransduktion, myelindannelse, dendritremodellering, neuropeptiddannelse og synaptogenese [160]. Det er vigtigt, at kolesterol ikke kan krydse blod-hjerne-barrieren (BBB), så alt kolesterol, som hjernen har brug for, skal syntetiseres in situ [161]. Derfor har hjernen komplekse og stramt regulerede kolesterolsynteseveje med flere akser af selvregulering for meget eller for lidt kolesterol er skadeligt og giver negative konsekvenser for kognition, hukommelse og motorik. For at opretholde homeostase kan kolesterol omdannes til oxysterol 24(S)-hydroxycholesterol (24S-OHC) af det neuronspecifikke enzym CYP46A1 (figur 4-en) [162]. Oxysteroler kan lettere passere lipofile membraner end kolesterol, hvilket giver mulighed for envejsudgang over BBB og ind i kroppen [163].

Figur 4. Kolesterolmetabolismen er forstyrret i Mecp2 mutante mus. (-en) Hos vildtypemusen producerer hjernen kolesterol in situ da kolesterol ikke kan passere blod-hjerne-barrieren (BBB). Acetyl-CoA går ind i kolesterolbiosyntesevejen for at lave kolesterol, som har mange essentielle funktioner (grønne trekanter). Enzymet CYP46A1 omdanner overskydende kolesterol til 24S-hydroxycholesterol (24S-OHC) for envejsudgang på tværs af BBB. Leveren deltager i kolesterolbiosyntesen for at give kolesterol til andre væv i kroppen. (b) I præsymptomatisk Mecp2 null-mus (3-4 uger gamle), øget ekspression af kolesterolbiosyntesegener i hjernen fører til forhøjede hjernekolesterolniveauer. Følgelig er udtryk for Cyp46a1 er øget, hvilket indikerer et øget behov for kolesterolomsætning. Uden for centralnervesystemet er serumkolesterol forhøjet, og ekspression af kolesterolbiosyntesegener er forhøjet i leveren. (c) I symptomatisk Mecp2 null mus (8-10 uger gamle), hjernen er mindre på grund af mangel på Mecp2. Kolesterolbiosyntesen falder drastisk i hjernen, sandsynligvis på grund af feedback fra forhøjede 24S-OHC. På grund af nedsat syntese forbliver hjernekolesterol højt, men ikke så højt som i yngre aldre (mindre rød pil). Serumkolesterol og/eller triglycerider kan også være forhøjet afhængigt af genetisk baggrund. Triglycerider ophobes i leveren, og fedtlever sygdom udvikler sig, som indikeret af bleg lever.

Abnormiteter i hjernens lipidhomeostase er forbundet med udviklingsforstyrrelser og ældningssygdomme. Neimann-Pick type C-patienter akkumulerer kolesterol i hjernen og perifert væv og præsenterer med symptomer, der ligner RTT, såsom tab af erhvervede verbale færdigheder og mangel på motorisk koordination [164]. Patienter med Smith-Lemli-Opitz syndrom udvikler mikrocefali, læbe/ganespalte, leverdefekter og autistisk adfærd på grund af en mangel på 7-dehydrocholesterol, hvilket muliggør den toksiske opbygning af kolesterolmellemprodukter [165]. Desuden er afvigende kolesterolhomeostase blevet impliceret i Fragilt X-syndrom [166], amyotrofisk lateral sklerose [167], Alzheimers [168], Parkinsons [169] og Huntingtons [170] sygdomme. Lipidanomalier var dog aldrig tidligere blevet beskrevet i RTT, og hvorvidt kolesterol spillede en primær rolle i sygdommens patologi var ukendt.

Påfaldende, Buchovecky et al. [156] fandt, at kolesterol-homeostase er forstyrret i Mecp2 null muse hjerne. Præ-symptomatisk, Mecp2 null helhjerne kolesterol er forhøjet, og Cyp46a1 ekspression er øget 38 % i forhold til vildtype-niveauer, hvilket indikerer et øget behov for kolesterolomsætning i neuroner [156] (figur 4)b). Postsymptomatisk nedsætter overproduktionen af ​​kolesterol sterolsyntesen i Mecp2 nul hjerner på grund af regulatorisk feedback [156.171] (figur 4c).

Især er metaboliske fænotyper forskellige i Mecp2 null mus på tværs af genetiske baggrunde. Mens begge 129.Mecp2 tm1.1Bird mus og B6.Mecp2 tm1.1Jae mus viser nedsat sterolsyntese i hjernen, forhøjet kolesterol og triglycerider i serum og lever er kun observeret hos 129.Mecp2 tm1.1Bird mus [156]. Derudover CD1.Mecp2 tm1.1Bird mus har en stigning i serumtriglycerider uden tilsvarende ændring i serumkolesterol [125]. Den indavlede C57BL/6 J-stamme og 129/Sv-understammerne styrer perifer kolesterolmetabolisme forskelligt, formentlig på grund af forskelle i transporten af ​​kolesterolnedbrydningsprodukter [172]. Sammen tyder disse data på, at forstyrret hjernekolesterolsyntese er et almindeligt træk ved Mecp2 null mus, men det er sandsynligt, at genetisk baggrund bidrager til Mecp2 nul perifer metabolisk fænotype.

Disse differentielle fund hos mus antydede, at perifere lipidmarkører ikke ville være forhøjede hos alle patienter. Konsekvent udviser kun en undergruppe af RTT-patienter øget serumkolesterol og/eller triglycerider [15,16,173]. Uden for CNS er steroler forstadier til steroidhormoner, galdesyrer og D-vitamin. Interessant nok har nogle RTT-patienter knogleabnormiteter, alvorlige mave-tarmproblemer og galdevejsforstyrrelser [174-176]. Da forstyrrelser i lipidhomeostase kan påvirke både neurologiske og ikke-neurologiske RTT-symptomer, kan måling af lipidparametre tjene som en ikke-invasiv og billig biomarkør til at identificere RTT-patienter, der kan drage fordel af behandlinger, der målretter mod lipidmetabolisme.

7. MeCP2 regulerer lipidmetabolismen med NCoR1/SMRT-HDAC3

NCoR1/SMRT-corepressorkomplekset er især en vigtig komponent i reguleringen af ​​den daglige kontrol af energimetabolisme. Under fastecyklussen optager NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset maksimalt hepatocytkromatin, hvilket undertrykker ekspressionen af ​​gener involveret i lipidsyntese og sekvestrering. Men under fodringscyklussen frigiver den kromatin, hvilket muliggør ekspression af dens målrettede loci [177]. Denne bindingsoscillation styrer skiftet mellem lipid- og glucoseudnyttelse i hepatocytter. Mus med en leverspecifik deletion af Hdac3 vise et øget udtryk for de novo lipogenese-enzymer på grund af et konstitutivt aktivt transkriptionelt miljø, hvilket resulterer i fedtleversygdom og forhøjet serumkolesterol [178,179]. Samlet set orkestrerer NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset lipogenese, og dets afbrydelse fører til forstyrret lipidhomeostase. Derfor var det forventet, at tab af MeCP2, den funktionelle bro mellem NCoR1/SMRT-HDAC3 og DNA, ville føre til transkriptionel dysregulering af lipogenese og metaboliske forstyrrelser hos mus. Til støtte for dette, SQL, suppressoren af ​​RTT-lignende fænotyper i mus, er et mål for HDAC3, og dets transkription øges ca. 170 gange som reaktion på Hdac3 leverdeletion [156,178].

Faktisk, Kyle et al. [180] viste det Mecp2 mutante mus udvikler alvorlig dyslipidæmi på grund af afvigende transskription af lipogenese-enzymer i leveren, fordi MeCP2 interagerer med NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset for at undertrykke lipogen gentranskription. Tab af MeCP2 nedsætter HDAC3-binding til DNA, hvilket resulterer i hyperacetylerede histoner og øger transkriptionen af ​​adskillige lipidregulerende gener. Interessant nok leverspecifik sletning af Mecp2 (B6.Mecp2 tm1Bird /YAlb-Cre) resulterer også i en stigning i lipogen enzymtransskription [180]. Svarende til Mecp2 null mus og en leverspecifik deletion af Hdac3, udvikler disse mus dyslipidæmi, fedtlever og stofskiftesygdomme. Disse resultater understøtter en hepatocyt-autonom rolle for Mecp2 ved at koordinere undertrykkelse af enzymer i kolesterol- og triglyceridbiosyntesevejene og viser, at tab af Mecp2 fra leveren er tilstrækkelig til at forårsage stofskiftesygdom hos mus. Det er især usandsynligt, at baggrundsstamme vil påvirke MeCP2's rolle i regulering af leverlipidsyntese, da både 129.Mecp2 tm1.1Bird og B6.Mecp2 tm1Bird /Y Alb-Cre mus viste forstyrret lipidmetabolisme.

8. Kolesterolsænkende statiner kan bruges til at behandle RTT

I betragtning af at kolesterolmetabolismen er forstyrret Mecp2 mus, var det muligt, at farmakologisk behandling med kolesterolsænkende lægemidler (statiner) ville forbedre symptomerne. Den primære virkningsmekanisme for statinlægemidler er kompetitiv inhibering af 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A reduktase (HMGCR), et hastighedsbegrænsende trin i kolesterolbiosyntese [181], hvilket effektivt reducerer den endogene produktion af kolesterol. På grund af kolesterols fremtrædende rolle i hjerte-kar-sygdomme ordineres statiner medicinsk for at forhindre åreforkalkning. Imidlertid er statiner forbundet med andre sygdomsforbedrende bivirkninger, såsom reduktion af inflammation [182,183] og negative bivirkninger, såsom muskelsvaghed [184] og akut hukommelsestab [185]. På grund af deres relative sikkerhed har nyere undersøgelser undersøgt, hvordan statinlægemidler kan genbruges til at behandle ikke-kardiovaskulære sygdomme, herunder Fragilt X-syndrom og neurofibromatose Type I [186,187].

Det er bemærkelsesværdigt, at behandling med enten fluvastatin eller lovastatin forbedrer subjektive sundhedsresultater, motorisk ydeevne (målt ved rotarod og åben feltaktivitet) og forlænger levetiden hos 129.Mecp2 tm1.1Bird han- og hunmutantmus sammenlignet med kontrolmus, der modtog et vehikel [156]. Lovastatin er det mere lipofile af disse statiner, hvilket øger sandsynligheden for at krydse BBB og komme ind i hjernen. Alligevel forbedrer behandling med begge statiner kolesterol-homeostase i hjernen Mecp2 mutante mus, sænker serumkolesterol og forbedrer lipidakkumulering i leveren. Interessant nok har lovastatin ikke en stærk terapeutisk effekt på B6.Mecp2 tm1.1Bird hanmus, der understøtter ideen om, at forhøjede perifere lipider kan være en biomarkør for de patienter, der kan reagere på statinlægemidler [188]. Ikke desto mindre understøtter disse resultater ideen om, at lipidmetabolisme, en vej, der har mange muligheder for lægemiddel- eller diætintervention, kunne udnyttes til symptomforbedring hos en undergruppe af RTT-patienter [156]. Det er vigtigt, at disse fund førte til et fase 2 klinisk forsøg til farmakologisk behandling af RTT med lovastatin (NCT02563860).

9. Implikationer for forståelse og behandling af børns neurologiske lidelser

Retts syndrom er fortsat en vanskelig lidelse at forstå og behandle, hovedsagelig fordi MeCP2 er central for reguleringen af ​​genekspression i mange væv og celletyper. Mere end 60 år efter beskrivelsen af ​​RTT som en metabolisk sygdom i nervesystemet er vi endelig kommet til en forståelse af nogle af de metaboliske aspekter af patologi (opsummeret i figur 5). På trods af dette varierer metaboliske parametre meget inden for RTT-patientpopulationen og blandt forskellige musestammer, hvilket indikerer, at genetisk variation kan spille en stor rolle i penetreringen af ​​metaboliske symptomer.

Figur 5. Metaboliske komponenter af Rett syndrom. Almindelige metaboliske forstyrrelser observeret hos RTT-patienter (blå firkanter), Mecp2-mutante musemodeller (grønne trekanter), der kan være et kendetegn ved menneskelig sygdom, eller i både mennesker og mus (lyserøde cirkler). Bemærk, at metaboliske parametre kan variere inden for patientpopulationen eller blandt forskellige musestammer: for eksempel blev hyperammonæmi fundet i en undergruppe af patienter, men blev droppet som et diagnostisk kriterium, fordi det ikke var almindeligt. Sådanne fund tyder på, at genetisk variation kan spille en stor rolle i penetreringen af ​​alle undtagen nøglediagnostiske træk.

I neuroner tjener MeCP2 som en bro mellem NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset og DNA for at lette transkriptionel undertrykkelse, og mutationer, der påvirker MeCP2-binding til komplekset, forårsager RTT. Mens begge Ncor1 og Hdac3 null mus dør som embryoner, en neuron-specifik deletion af Hdac3 producerer levedygtige mus, der gradvist udvikler en fænotype, der ligner meget Mecp2 null mus inklusive unormal motorisk koordination, reduceret selskabelighed og kognitive defekter [189]. Disse data tyder på, at mindst en undergruppe af RTT-lignende fænotyper i Mecp2 mutante mus er forårsaget af tab af HDAC3 i neuroner. Desuden er rollen for NCoR1/SMRT-HDAC3 i regulering af lipogenese i Mecp2 muselever rejser interessante spørgsmål om rollen af ​​dette kompleks i reguleringen af ​​lipider i hjernen. Biokemiske undersøgelser har stort set undladt at finde definitive genregulatoriske mål, til dels fordi MeCP2 binder DNA på niveauer, der konkurrerer med histonoktamerer [190]. Desuden er hjernen et komplekst organ med mange forskellige celletyper i forskellige aktivitetsstadier, hvilket gør studier af hele hjernen svære at fortolke. Det er sandsynligt, at MeCP2 på bestemte tidspunkter og i specifikke celler er påkrævet for at forankre NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset til DNA, der regulerer lipidproduktionen i nogle celler i hjernen som i leveren.

Da kolesterolsyntese er en ressourcedyr proces, tyder nuværende data på, at nyfødte neuroner skal producere kolesterol på en celleautonom måde, men når de modnes, outsourcer de produktionen til astrocytter (gennemgået i [160,191]). Interessant nok har vildtype-neuroner unormal dendritisk morfologi, når de dyrkes sammen med MeCP2-deficiente astrocytter, men alligevel har MeCP2-deficiente neuroner normal dendritisk morfologi, når de dyrkes sammen med vildtype-astrocytter [192]. Desuden inducerer deletion af MeCP2 fra gliaceller en RTT-lignende fænotype og genintroducerer MeCP2 til astrocytter af Mecp2 null mus, der bruger GFAP-Cre, forbedrer symptomer og genopretter dendritisk morfologi [193,194]. Disse data kan forklares med hypotesen om, at kolesterolsyntese på et tidspunkt under udviklingen reduceres i en undergruppe af neuroner og i stedet leveres af astrocytter i RTT-hjernen, denne nedregulering forekommer ikke, hvilket fører til lipidakkumulering [160]. Denne mulighed kan bestemt også forklare forskellen i tidspunktet for indtræden af ​​symptomer hos mus og mennesker, fordi nedreguleringen af ​​kolesterolsyntese i neuroner kort tid forud for indtræden af ​​RTT-lignende symptomer hos mus. Nye tilgange leveret af enkeltcellede genomiske teknologier kan give endelige svar på denne mulighed.

Metabolisk dysregulering i RTT og andre sygdomme kan give betydelige konsekvenser på downstream-systemer. Når en arm af stofskiftet forstyrres, påvirker det hver forbindelsesvej, inklusive glucose, lipid, aminosyre, nitrogen og mitokondriel respiratorisk metabolisme. Ikke overraskende er både RTT-patienter og Mecp2 mutante mus har unormale reaktioner på glucosetolerancetest, og mutante mus er også insulinresistente [180,195]. Fordi Mecp2 mus fortrinsvis metaboliserer fedt frem for glukose som deres primære energikilde, er det sandsynligt, at andre energisansende systemer påvirkes. Specifikt påvirker energimetabolisme den post-translationelle modifikation af proteiner med O-bundet N-acetylglucosamin (O-GlcNAc), en næringsdrevet epigenetisk regulator [196,197]. Reguleringen af ​​O-GlcNAc er nødvendig for mange proteiner involveret i neurogenese, og forstyrrelse af O-GlcNAc-proteinmodifikation er allerede blevet forbundet med mange neurologiske sygdomme, herunder Alzheimers [196,198]. Unormal hjerneglukose-lipid-homeostase er også forbundet med oxidativt stress ved Alzheimers [199]. RTT-patienter har øget oxidativ byrde og unormal mitokondriel struktur, mens RTT-dyremodeller har defekter i den mitokondrielle respiratoriske kæde [23,26,200-202] og oxidative ændringer i hjernen [203]. Derudover er unormal lipidmetabolisme direkte forbundet med inflammation [204], som er en komponent i patologi i både typiske og atypiske tilfælde af RTT [205]. Især MeCP2 undertrykker direkte Irak1 og nedregulering af NF-κβ-vejen forbedrer symptomer i Mecp2 null mus [206].

Forståelsen af ​​metaboliske aspekter af RTT-patologi afslører potentielle terapeutiske indgreb. Statinlægemidler tegner sig kun for én familie af talrige metaboliske modulatorer, der udvikles til behandling af lipidakkumulering eller insulinresistens ved type II-diabetes, som kan bruges til at behandle RTT. Hvert år testes nye lægemiddelbehandlinger ind Mecp2 dyremodeller, der redder forskellige aspekter af RTT-fænotyper. For eksempel behandlingen af Mecp2 null mus med en protein-tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) antagonist, der blev udviklet til at behandle type II diabetes forlænget levetid, nedsat bagbens spænding og forbedret motorisk ydeevne [207]. På samme måde normaliserede Trolox, et vitamin E-derivat, blodsukkerniveauer, reducerede oxidativt stress og forbedret udforskende adfærd i Mecp2 mus [208]. Derudover reddede insulinlignende vækstfaktor (IGF-1) delvist lokomotorisk aktivitet, åndedrætsfunktion og hjertefrekvens i Mecp2 mus [209.210]. Ud over statiner er fase 2 kliniske forsøg for RTT i gang for en liste over potentielle behandlinger, herunder IGF-1 (NCT01777542), EPI-743 (NCT01822249), triheptanoin (NCT03059160) og NNZ-2566 (NCT01703533). Men på trods af dette fremskridt har ingen enkelt behandling endnu fastgjort hver fænotype Mecp2 mus eller alligevel vist sig effektivt at behandle RTT-symptomer.

Mens MeCP2 er i vid udstrækning blevet undersøgt i CNS udvikling og modning, kan nogle klinisk signifikante aspekter af RTT opstå uafhængigt af MECP2 mangel i nervesystemet, og bør overvejes ved planlægning af enhver behandlingsstrategi. I betragtning af sammenhængen mellem MeCP2 og HDAC3 bør ikke-specifikke HDAC-hæmmere, almindeligvis ordineret til vedligeholdelse af anfald, behandles med forsigtighed som en behandling ved RTT. Derudover kan både RTT-patienter og Mecp2 mutante mus til stede med metabolisk syndrom [15.180], oxidativt stress [27.29], hjertedefekter [211.212], nedsat knogletæthed [174.213] og urologisk dysfunktion [214.215]. Da CNS-målrettet genterapi bliver en mere realistisk terapeutisk tilgang, skal perifer mangel på MeCP2 overvejes mere end nogensinde, da disse symptomer sandsynligvis vil fortsætte efter målrettet genetisk behandling af hjernen.

Endvidere bør mutationer i medlemmer af NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset undersøges for roller i andre neurologiske børnesygdomme. Mutationer i andre komponenter af komplekset, TBLR1 og TBL1, er allerede blevet forbundet med autisme, intellektuelle handicap, Pierpont syndrom, en lidelse karakteriseret ved udviklingsforsinkelse og unormal fedtfordeling i de distale lemmer, og West syndrom, en lidelse med RTT- lignende funktioner [216-219]. Navnlig blev seks af disse mutationer i TBLR1 kortlagt til WD40-domænet af proteinet og forstyrrede MeCP2-binding [150]. Derfor kunne NCoR1/SMRT-kompleksets transkriptionelle funktion repræsentere en fælles mekanisme for autismespektrumforstyrrelser og andre neurologiske tilstande. Sammenligning af transkriptomet af mus med genetiske deletioner af Mecp2 og medlemmer af NCoR1/SMRT-HDAC3-komplekset kan tilbyde en omfattende liste over gener reguleret af denne interaktion, som kan studeres for bedre at forstå sygdomspatologi og udnyttes til at udvikle potentielle behandlinger. Samlet set vil fremskridtet med at forstå det mekanistiske grundlag for RTT-patologi fortsætte med at informere andre neurologiske sygdomme og komplekse epigenetiske mekanismer.


Epidemiologi af kardiovaskulære toksiner

Churchill Lukwiya Onen, i Heart and Toxins, 2015

1.2.2 Hjerteglykosidholdige planter

Den forskelligartede gruppe af planter, der indeholder hjerteglykosider, omfatter Digitalis purpurea, Digitalis lanata, Nerium oleander, Thevetia peruviana, og Strophanthus gratus. Frøene har den højeste koncentration af glykosid (4,8 %), hvorimod bladene, frugten og mælken fra planterne indeholder henholdsvis cirka 0,07 %, 0,045 % og 0,036 % glykosid. Gamle egyptere og romere brugte længe hjerteglykosidholdige planter som opkastningsmidler og mod hjertesygdomme. Imidlertid blev deres toksicitet først anerkendt i 1785 efter den skelsættende udgivelse af William Withering. 7 I andre lande er oleander blevet brugt som lægeplante til behandling af spedalskhed, ringorm, malaria og seksuelt overførte sygdomme og som abortmidler og appetitvækkere. Toksicitet kan opstå ved indtagelse af te brygget fra plantedele eller efter indtagelse af blade, blomster, blomster, saft, bær eller frø fra planter, der indeholder hjerteglykosider eller fra uhensigtsmæssig terapeutisk selvadministration af planteekstrakter eller under selvmordsforsøg. Toksiske manifestationer er identiske med digoxinoverdosis og omfatter kvalme, opkastning, diarré, unormale hjerterytmer, sinusknudedysfunktioner, atrioventrikulære blokeringer og for tidlige ventrikulære sammentrækninger.

Indtagelse af planter, der indeholder hjerteglykosider, er angiveligt sjældent i USA. Ud af de 1,33 millioner eksponeringer for ikke-farmaceutiske stoffer rapporteret til American Association of Poison Control Centers i 2006, skyldtes kun 1405 (0,1%) eksponeringer for hjerteglykosidholdige planter. 8 I Sri Lanka og Indien, øget selvmords- eller parasuicidal indtagelse af gul oleander (Thevetia peruviana) er forbundet med dødsfald på 5 til 10 % hos ubehandlede ofre. 9 Toksicitet opstår med serumdigoxinniveauer på >15 ng/ml. Påvisning af digoxinforgiftning med planteoprindende hjerteglykosid er vanskelig og kompliceret at fortolke, og analyser kan muligvis ikke påvise alle planteformer af hjerteglykosider. 10 Botanisk identifikation af den mistænkte plante er nyttig. Sygelighed relateret til hjerteglykosider forværres af fremskreden alder, nyreinsufficiens, myokardieiskæmi, hypothyroidisme, hypoxi og elektrolyt-ubalancer, især hypokaliæmi, hyperkaliæmi, hypomagnesiæmi og hypercalcæmi. Plantespecifikke determinanter for sygelighed relateret til hjerteglykosidforgiftning omfatter plantearter, en del af planten, der er indtaget, specifik type glycosid indeholdt og koncentrationen af ​​glycosid i plantedele indtaget, men dødeligheden er sjælden.

Akut digoxin-toksicitet forekommer ofte hos yngre patienter og er forbundet med lavere dødelighedsrisiko. Ældre patienter har højere dødelighedsrisiko, især dem med kronisk digoxin-toksicitet og komorbiditeter såsom hjerte- og nyresygdomme. Forebyggelse af yderligere eksponering for plante-oprindende hjerteglykosid omfatter fjernelse af plantedelene, især fra patienter med selvmordstendenser. Ødelæggelse af plantekilder, afskrækkende foranstaltninger for at minimere menneskers adgang til sådanne planter og offentlig oplysning om farerne forbundet med uretfærdig brug af hjerteglykosidholdige planter er passende folkesundhedsstrategier. Politikker, der modvirker potentielt skadelige botaniske kosttilskud, anbefales. 11


Mikrobiota i insektsvampepatologi

Der er gjort betydelige fremskridt i den biokemiske og genetiske karakterisering af vært-patogen-interaktionen medieret af insektpatogene svampe, hvor den mest studerede er Ascomycetes (Hypocrealean) svampe, Metarhizium robertsii og Beauveria bassiana. Imidlertid har få undersøgelser undersøgt konsekvenserne og virkningerne af værts(insekt)mikrober, hvad enten de er kompatible eller antagonistiske, på udviklingen og overlevelsen af ​​entomopatogene svampe. Værtsmikrober kan virke på insektets kutikulære overflade, inde i tarmen, i specialiserede insektmikrobeværtsstrukturer og inde i celler, og de inkluderer en bred vifte af fakultative og/eller obligate exosymbionts og endosymbionts. Insektmikrobiomet adskiller sig på tværs af udviklingsstadier og som reaktion på ernæring (f.eks. forskellige planteværter for planteædere) og miljøforhold, herunder eksponering for kemiske insekticider. Her gennemgår vi de seneste fremskridt, der indikerer, at insektpatogene svampe har udviklet et spektrum af strategier til at udnytte eller undertrykke værtsmikrober, herunder produktionen af ​​antimikrobielle forbindelser, der udtrykkes på diskrete stadier af infektionsprocessen. Omvendt er der stigende evidens for, at nogle insekter har erhvervet mikrober, der kan være specialiserede i produktion af svampedræbende forbindelser for at bekæmpe infektion med (entomopatogene) svampe. Overvejelse af insektmikrobiomet i svampeinsektpatologi repræsenterer en ny grænse, der kan hjælpe med at forklare tidligere obskure økologiske og patologiske aspekter af biologien af ​​entomopatogene svampe. Sådan information kan føre til nye tilgange til at forbedre effektiviteten af ​​disse organismer i bekæmpelse af skadedyr.

Dette er en forhåndsvisning af abonnementsindhold, adgang via din institution.


6 PÅVIRKNING AF DYSREGULERET CIRKADISK UR PÅ DET Hjerte- og karsystem

6.1 Det cirkadiske ur i kardiovaskulære celler

I hjertet viser cirka 13 % af generne og 8 % af proteinerne døgnrytme i løbet af dagen (Thosar, Butler & Shea, 2018). Oscillerende cirkadiske gener påvirker aktiviteten af ​​endotelceller, fibroblaster og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs Takeda et al., 2007) og hjælper med at opretholde normal kardiovaskulær fysiologi.

Endotelceller bliver mere modtagelige for skader med polymorfismer i Bmal1, hvilket øger risikoen for at udvikle hypertension (Durgan & Young, 2010). Fibroblaster viser oscillationer i cirkadiske urgener, når de dyrkes i cellekultur (Crnko et al., 2019). VSMC'er har vist sig at have synkrone, oscillerende døgnrytmer i løbet af dagen, stimuleret af induktionen af ​​angiotensin II, som er en Zeitgeber til VSMC'er (Nonaka et al., 2001). Blodkoagulationsmarkører viser nat- og dagmønstre. Thrombomodulin, et gen, der regulerer intravaskulær koagulation i vaskulære endotelceller, viser cirkadiske svingninger. Oscillation af thrombomodulin-genekspression blev afskaffet i urmutante mus og blev ændret ved tidsbestemt fodringsrestriktion, hvilket tyder på, at dets ekspression er under kontrol af det perifere ur (Takeda et al., 2007). Vores gruppe fandt oscillerende urgener i humane føtale og voksne hjertestamceller. Døgnrytme påvirkede deres evne til at formere sig, tolerere forskellige stressfaktorer og udskille parakrine faktorer (Du Pre et al., 2017). Endelig er normal vaskulær funktion i hjertet afhængig af døgnuret. Dyreforsøg har vist, at mus med mutationer i Per 2 lider af endoteldysfunktion, karakteriseret ved en nedsat produktion af NO og vasodilatatoriske PG'er og øget produktion af vasokonstriktorer (Viswambharan et al., 2007). Mus med mutant Per 2 viser svækket angiogenese, øget senescensmarkørekspression på deres endoteliale progenitorceller (EPC'er) og nedsat blodgennemstrømning, når de reagerer på iskæmi (Wang et al., 2008). Flere eksempler kan findes i Understøttende information.

Udover at blive reguleret via neurohumoral input, er hjertefrekvensen også under direkte kontrol af cardiomyocyte-cirkadisk ur. Radiotelemetriundersøgelser har vist, at kardiomyocytter fra urmutante mus har bradykardi og reducerede daglige variationer i hjertefrekvens sammenlignet med WT-mus. Hjertekraften var højere i WT-mus sammenlignet med cardiomyocyt-ur-mutantmus, uden at der blev fundet ændringer i mitokondriel funktion i kardiomyocytterne (Bray et al., 2008).

Fungerende døgnrytmer spiller også en rolle i at beskytte hjertet mod stress-inducerede skader. Noradrenalin fungerer som en Zeitgeber for kardiomyocytter, inducerer den cirkadiske ekspression af dehydrogenase kinase isozym eller afkobling af protein-3, som beskytter kardiomyocytter mod ROS og stress-induceret myokardieskade (Wang et al., 2010). Arterielt blodtryk (BP), der er afgørende for at opretholde normal kardiovaskulær fysiologi, viser en rytme, der topper midt om morgenen og falder langsomt i løbet af dagen (Floras et al., 1978). En stigning i BP øger efterbelastningen på kardiomyocytter, hvilket stimulerer frigivelsen af ​​atrielt natriuretisk peptid (ANP), et kardiobeskyttende middel, der beskytter kardiomyocytter mod skader forårsaget af stigningen i afterload (Takeda & Maemura, 2015). Nondipper er et udtryk, der beskriver mennesker, der ikke udviser et fald eller fald i BP om natten. Denne kohorte af mennesker er mere tilbøjelige til at have venstre ventrikulær hjertehypertrofi og har en øget risiko for at dø af kardiovaskulære hændelser (Fagard et al., 2009) sammenlignet med personer, der har normal BP eller daglig/dyppe hypertension, hvilket yderligere beviser, at de har normal dagligt blodtryk. mønstre i BP kan bidrage til normal kardiovaskulær fysiologi (Reitz & Martino, 2015).

6.2 Døgnrytme i kardiovaskulær patofysiologi

Hjerte-kar-sygdomme er en af ​​de førende årsager til sygelighed og dødelighed i verden. Der er rigelig eksperimentel og klinisk evidens, der tyder på en signifikant sammenhæng mellem døgnrytmer og udvikling eller progression af hjerte-kar-sygdomme (Rabinovich-Nikitin, Lieberman, Martino, & Kirshenbaum, 2019, figur 4). Synkrone døgnrytmer er essentielle for det normalt fungerende kardiovaskulære system (Crnko et al., 2019). Men i nogle patologiske tilstande kan det cirkadiske ur være forstyrret. Der er voksende epidemiologisk evidens, der tyder på, at miljømæssige og eksterne faktorer såsom depression, angst, social isolation, skifteholdsarbejde, støj og luftforurening kan aktivere oxidativ stress, øge ubalance i det autonome nervesystem og vaskulær dysfunktion, hvilket kan føre til udvikling af kardiovaskulær sygdomme. Debuten af ​​forskellige hjerte-kar-sygdomme, såsom MI, ventrikulære arytmier og pludselig hjertedød viser daglige variationer, derudover kan udfaldet også være relateret til tidspunktet for debut (Reitz & Martino, 2015).

Skiftsarbejdere og personer, der lider af søvnapnø, er mere tilbøjelige til at udvikle hjerte-kar-sygdomme på grund af forstyrrelser i deres søvnmønster, som dysregulerer deres døgnrytme ved at ændre heterodimeriseringsmønsteret af Bmal1-UR (Reitz & Martino, 2015). Det er også blevet postuleret, at ændringer i det maksimale og minimale input i den kardiale vagale autonome og sympatiske nervekontrol bidrager til den massive stigning i hjerte-kar-sygdomme hos skifteholdsarbejdere (Furlan et al., 2000).Ændringer i mental og fysisk aktivitet i løbet af dagen påvirker døgnrytmerne i BP (Degaute, van de Borne, Linkowski, & Van Cauter, 1991). Flere eksempler kan findes i Understøttende information.

Som tidligere nævnt er der større sandsynlighed for, at akut MI (AMI) opstår i de tidlige timer om morgenen (Takeda & Maemura, 2011). De underliggende mekanismer for denne observation involverer både de centrale og perifere døgn-ure. Hjertefrekvens, vasokonstriktion af blodkar og blodtryk er alle forhøjet om morgenen, hvilket øger energibehovet og mindsker blodgennemstrømningen til hjertet (Kurnik, 1995). Plasminogenaktivatorhæmmer-1 og andre blodpladeoverflademarkører er også forhøjede om morgenen, hvilket også bidrager til den øgede forekomst af AMI om morgenen (Tofler et al., 1987). Miljøfaktorer har vist sig at øge forekomsten af ​​AMI. Skiftet fra vinter til sommer har vist sig at forstyrre døgnrytmen og påvirke mængden og kvaliteten af ​​søvn en person får. Forekomsten af ​​AMI steg signifikant 3 uger efter denne eksterne tidsnulstilling, med en mere udtalt forskel hos kvinder end hos mænd (Janszky & Ljung, 2008). Urmutantmus udviste ændret immuncelleinfiltration efter MI, og nedsat blodkardannelse blev observeret 1 uge efter MI i den proliferative fase og forværrede resultater (Alibhai et al., 2014). Flere detaljer kan findes i støtteoplysningerne.

Desynkroniserede døgnrytmer har vist sig at forårsage dilaterede kardiomyopatier. Allestedsnærværende knockout af Bmal1 forårsager dilateret kardiomyopati hos mus en kardiomyocytspecifik Bmal knockout-model beviste den rolle, som kardiomyocytt cirkadisk ur spiller for at opretholde rytmiciteten af ​​transkriptomet (Young et al., 2014). Hamstere, der har en mutant allel af det circadian clock-relaterede gen casein kinase 1 epsilon (CKIƐ Hurd & Ralph, 1998) har reduceret circadian periodicitet fra 24 til 22 timer og øget forekomst af hjertepatologi.


Introduktion

I 2009 blev en ny infektionssygdom karakteriseret ved svær feber, trombocytopeni, leukocytopeni og multiorgan dysfunktion identificeret som værende forårsaget af et nyt medlem af slægten phlebovirus i Bunyaviridae-familien i Kina [1]. Sygdommen blev først identificeret som den svære feber med trombocytopeni syndrom (SFTS) i det centrale og nordøstlige Kina i 2008 [2]. SFTS har en gennemsnitlig dødsrate på 12 % og endda 30 % i nogle områder. Rapporter, der har refereret til kliniske symptomer på SFTSV-infektion, er enten case-rapporter eller korte rapporter, og de detaljerede kliniske træk ved tilfælde med SFTS-virus (SFTSV)-infektion er ikke blevet godt beskrevet. Adskillige undersøgelser har beskrevet faktorer forbundet med død hos SFTSV-patienter. Imidlertid vurderede tidligere publicerede værker risikofaktorer for død ved univariat analyse, og risikofaktorerne for sværhedsgrad blandt SFTS-patienter og dødsfald blandt svære SFTS-patienter skal stadig bestemmes.

Vi stødte på patienter med SFTSV-infektion begyndende i juni 2010. De vigtigste kliniske syndromer i kritiske tilfælde var bevidsthedsforstyrrelse, svær lungebetændelse, hæmoragiske tegn, koagulopati, nedsat nyrefunktion og arytmi, som viste sig med mere alvorlige symptomer og laboratorieabnormaliteter [end hidtil] 1-3]. Patienter med kliniske træk ved SFTS udviste mere alvorlige komplikationer end andre sygdomme forårsaget af bunyavirus (sandfluefeber, hæmoragisk feber med nyresyndrom, Rift Valley-feber og Krim-Congo hæmoragisk feber) [4-7]. Patienter med SFTSV-infektion i det nordøstlige Kina er hovedsageligt distribueret i Liaoning-provinsen. Vi opsummerer de kliniske træk, resultater og risikofaktorer forbundet med sværhedsgraden blandt SFTS-patienter og dødsfald blandt svære SFTS-patienter i Liaoning, Kina fra juni 2010 til december 2011.


Resultater og diskussion

Vores motivation til at udvikle MaGelLAn-softwaren kom fra manglen på tilstrækkelige værktøjer til at løse de problemer, vi stødte på i vores forskning om indflydelsen af ​​mitogenom-variabiliteten på kvantitative egenskaber i store populationer. Til at begynde med, da antallet af sekventerede individer fra vores stamtavler steg til hundredvis, havde vi brug for en beregningsmæssig tilgang til stamtavlekonkordansproblemet. Som følge heraf udviklede vi andre komponenter i MaGelLAn 1.0 for at muliggøre udarbejdelsen af ​​de data, der er nødvendige for at analysere virkningen af ​​mitogenompolymorfien på kvantitativ egenskabsvariation. Derudover beregner MaGelLAn 1.0 parametre, såsom mitogenom og mødres slægts effektive populationsstørrelser, som er nyttige til bevarelsesstyring af små populationer. Da kvantitative egenskabsanalyser er baseret på store datasæt, bruger MaGelLAn 1.0 de passende beregningsmetoder, der effektivt kombinerer stamtavle og molekylær information. Hovedmålet var at bygge grundlaget for ressourcer, der kan bruges yderligere til at forbinde mitogenominformationen med et stort antal tilgængelige fænotyper.

Når det drejer sig om nukleare markører og autosomal arv, vil flere programmer have de samme eller lignende funktioner som MaGelLAn 1.0. For eksempel findes der programmer, der kan korrigere stamtavlefejl [37] og beregne effektive populationsstørrelser og co-herkomstkoefficienter [38, 39], men kun for stamtavledataene. Nogle andre programmer, der kun er baseret på molekylær information, kan beregne effektiv populationsstørrelse [40�] og molekylær sammenhæng [43], kontrollere, om stamtavler er i overensstemmelse med molekylære data [44, 45], eller muliggøre imputering af molekylær information til stamtavle-relaterede individer [46, 47]. Men komplementært til alle eksisterende værktøjer er MaGelLAn 1.0 den eneste software beregnet til at dække specificiteterne af analysen af ​​mitogenomet. Det er især rettet mod de forskere, der er interesserede i analysen af ​​mitogenomets indvirkning på kvantitativ egenskabsvariabilitet. Vi mener, at MaGelLAn vil hjælpe med at øge forståelsen af ​​denne påvirkning i populationer med registrerede stamtavleoplysninger.

Med hensyn til kodeorganisering og softwareingeniøraspekter er MaGelLAn implementeret gennem brugervenlige Python3-scripts med selvforklarende variabelnavne og funktioner, der er lette at forstå og kan genbruges i andre lignende applikationer. Nogle af input- og verifikationsprocedurerne, der bruges i alle moduler, kunne have været implementeret som eksterne funktioner. Der er dog nogle forskelle i den indledende behandling, og vi mener, at dette ville mindske kodens læsbarhed. Derudover var vores hensigt at holde individuelle moduler bærbare. Med intentionen om at holde softwaren så nem at bruge og administrere som muligt, valgte vi at undgå brugen af ​​switches og de eksterne rutiner.

Et eksempel på en typisk brug af MaGelLAn suiten, når man har med en ny stamtavle at gøre, er vist i Fig.  1 . Men afhængigt af tilstanden af ​​de særlige stamtavledata og typen af ​​de nødvendige oplysninger, kan modulerne bruges i forskellige kombinationer eller separat. MaGelLAn 1.0. dækker et omfattende sæt af funktionaliteter, der er nødvendige for vores forskning. Vi er åbne for muligheden for, at flere funktionaliteter vil blive tilføjet til MaGelLAn med tiden, og vi inviterer andre interesserede forskere til at bidrage med forslag til nye funktionaliteter eller med deres egen kode.