Information

VPg-priming af replikationen af ​​RNA-vira

VPg-priming af replikationen af ​​RNA-vira



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeg laver en præsentation om replikationen af ​​SARS-CoV-2 til min kemiklasse, og jeg fandt ud af, at for at replikere dets RNA, bruger virussen RNA-afhængig RNA-polymerase, som primes af en VPg-primer. Da præsentationen er for en kemiklasse, ikke en molekylærbiologiklasse, vil jeg gerne vide kemien bag den måde, primere fungerer på.

Jeg har prøvet at søge i oplysningerne på internettet, men kunne ikke finde de oplysninger, jeg har brug for.


Selvom dette spørgsmål sandsynligvis bør afgøres uden for emnet som uforsket hjemmearbejde, tror jeg, at ikke alle læsere vil være bekendt med VPg-primeren til viral RNA-replikation. Jeg vil derfor foreslå nogle af de kemiske aspekter af denne proces, som kan indgå i en præsentation, og kommentere selve processen.

Nogle kemiske træk ved VPg-primet viral RNA-replikation

  1. Den kemiske reaktion. Dette er ikke anderledes end mange andre reaktioner, der involverer en RNA-polymerase. Det involverer reaktionen af ​​en NTP med 3'OH af ribosen på en voksende RNA-kæde, der danner en phosphodiesterbinding, og dermed forlænger kæden. Den voksende RNA-kæde kaldes en primer, fordi den er påkrævet for at starte tilføjelsen i mange tilfælde, men i tilfælde af mange enkeltstrengede RNA-vira bruger den faktiske initiering af en ny streng en primer, der består af et lille peptid, hvortil rester er vedhæftet. Simple diagrammer af denne proces præsenteres generelt for DNA-afhængig DNA-polymerase og kan findes i standardtekster, f.eks. Berg et al. Figur 5.22

  2. Reaktionsmekanismen. Denne reaktion katalyseres af et enzym, som deltager i reaktionen. Katalysemekanismen er opsummeret på EBI-faciliteten (hvor diagrammer kan findes) som:

RNA-polymeraser katalyserer det nukleofile angreb af et bundet nukleosid 5'-triphosphat af 3'-hydroxyl af en RNA-primer, hvilket resulterer i inkorporering af et nukleosid monophosphat i RNA og frigivelse af pyrophosphat. Dette menes at ske ved hjælp af to-metal katalyse. I RNA-polymerase II er to magnesiumioner koordineret af fire aspartater (3'OH af RNA foreslås også svagt koordineret til Mg2+EN). Mg2+A foreslås at sænke pKa omkring den angribende hydroxyl, mens Mg2+B er der for at stabilisere de negative ladninger under overgangstilstand...

  1. Reaktionens termodynamik. Brydningen af ​​en phosphodiesterbinding og dannelsen af ​​en anden betyder, at reaktionen er mere eller mindre i ligevægt (ingen ændring i Gibbs Free Energy). En grund til, at det menes ikke at vende, er fordi det producerede pyrophosphat hydrolyseres i cellen til orthophosphat, hvilket er irreversibelt, da den frie energiændring i denne reaktion går tabt som varme.

  2. Hydrogenbinding til skabelonen. Reaktionen involverer kopiering af en skabelonstreng, og grundlaget for denne specificitet er Watson-Crick-hydrogenbinding mellem skabelonbase og indkommende NTP. Specifikt for VPg-primeren er der imidlertid hydrogenbinding af de to U-rester til enden af ​​skabelonstrengen. (Diagrammer over AU-hydrogenbinding bør være lette at finde.)

  3. Den kemiske binding af VPgUU-primeren. Uridylsyreresterne tilsættes til VPg-peptidet ved hydroxylgruppen af ​​en tyrosinrest i en reaktion, der katalyseres af den virale RNA-polymerase. Det er værd at bemærke, at selvom mange aminosyrerester i proteiner er kemisk inerte, har hydroxyaminosyrerne et reaktivt potentiale, især ved at blive phosphoryleret.

Et bredere punkt til eftertanke

Et spørgsmål, som dette rejser, er, hvorfor behovet for et protein - VPg - som supplement til en nukleinsyreprimer. Læsning yderligere om emnet vil afsløre, at dette protein faktisk interagerer med forskellige dele af det virale RNA i løbet af erhvervelsen af ​​Uridylat-resterne og udvælgelsen af ​​AA'en, hvor det skal bindes. De kemiske interaktioner med RNA og andre proteiner her er de svage ikke-kovalente interaktioner - hydrogenbindinger, van der Walls interaktioner og nogle ioniske interaktioner - som er typiske for proteiner. I stedet for at deres svaghed er en grund til at betragte dem som uvæsentlige, er sådanne interaktioner afgørende for livets kemi, fordi selve deres svaghed betyder, at de kan være både ødelagt og lavet. Interaktionerne er reversible, hvilket fører til det meget dynamisk egenskab, der kendetegner livet. De fortjener en kemikers opmærksomhed.


Nukleinsyresyntese kan forekomme på to måder, med en skabelon eller uden. I de fleste biologiske systemer er skabelonsyntesen den, der forekommer, da det er den eneste måde at replikere genomisk information. Til skabelonbaseret nukleinsyresyntese i biologiske systemer (er af DNA eller RNA) kan enzymerne, der udfører reaktionerne, bruge enkeltstrenget materiale (i tilfælde af virus ssDNA eller ssRNA virus), men de har stadig brug for en lille region af dobbeltstrenget nukleinsyre for at binder og begynder at polymerisere, ellers kunne syntese starte hvor som helst i skabelonstrengen, hvilket ikke ville være særlig nyttigt, derfor binder primerne, polymeraserne til det dobbeltstrengede område og begynder at polymerisere og tilføjer altid nye nukleotider til 3'-enden af ​​primerstrengen som er komplementære til nukleotidet i skabelonstrengen. Normalt i levende celler vil syntesen af ​​nye RNA-molekyler ikke forekomme med en RNA-skabelon (der er normalt ingen RNA-afhængig RNA-polymerase, der er undtagelser, men de er normalt et resultat af tidligere virusinfektioner), men kun med en DNA-skabelon til at fremkalde messenger/transfer/ribossomale RNA'er. I tilfælde af COVID og anden streng RNA-virus skal virussen kode for RNA-polymerasen og også producere en primer, der vil skabe en dobbeltstrenget region, der vil tillade RNA-syntese at finde sted.


RNA-virusreplikationskomplekser

Ophavsret: © 2010 Tao, Ye. Dette er en artikel med åben adgang distribueret under vilkårene i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat at den oprindelige forfatter og kilde krediteres.

Finansiering: Forfatterne modtog ingen specifik finansiering til dette manuskript.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer nogen konkurrerende interesser.

Størstedelen af ​​vira, der inficerer dyr og planter i dag, er RNA-vira [1]. Der er dobbeltstrengede (ds) RNA-vira med dsRNA-genomer, såvel som (+)- og (−)RNA-vira, hvis genom er enkeltstrenget (ss) RNA med enten positiv eller negativ polaritet. RNA-vira har små genomer, der sjældent overstiger 30 kb i størrelse, og en stor del af deres genomer bruges til at kode for proteiner involveret i viral RNA-replikation. Viral RNA-syntese katalyseres af den viralt kodede RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRp), som mangler enhver korrekturlæsningsaktivitet. Selvom detaljerne om RNA-replikation varierer meget blandt vira, eksisterer der tydeligvis fælles principper i organiseringen af ​​replikationsmaskineriet for forskellige RNA-vira.


Hvorfor poliovirusreplikation er blevet undersøgt i mere end 50 år

Poliovirus er det ætiologiske agens af poliomyelitis, en akut slap lammelse, der rammer 1%-2% af inficerede patienter og i sjældne tilfælde forårsager døden ved at lamme muskler, der kontrollerer halsen eller vejrtrækningen. Et slående træk ved infektion er livslange handicap, som kan påvirke overlevende af den akutte sygdom. Overført via fækal-oral og oral-oral vej, denne virus (tre serotyper) var en af ​​de mest frygtede patogener i industrialiserede lande i løbet af det 20. århundrede, der ramte hundredtusindvis af børn hvert år via udbrud i varme sommermåneder. Selvom der er yderst effektive vacciner til at kontrollere poliomyelitis, forbliver den endemisk i nogle få lande, hvorfra spredning og udbrud fortsat forekommer over hele verden. Siden opdagelsen i 1908 er poliovirus blevet intensivt undersøgt for bedre at forstå og kontrollere dette formidable patogen. Historien om poliovirus er dog ikke begrænset til kampen mod sygdommen. Poliovirusreplikationsundersøgelser har også spillet en vigtig rolle i udviklingen af ​​moderne virologi, siden poliovirologer og mere generelt picornavirologer har været pionerer inden for mange områder af molekylær virologi. Poliovirus var f.eks. det første animalske RNA-virus, der fik sin fuldstændige genomsekvens bestemt, det første RNA-dyrevirus, for hvilket der blev konstrueret en infektiøs klon, og sammen med det beslægtede rhinovirus, det første humane virus, der havde sin tredimensionelle struktur løst ved røntgenkrystallografi. Faktisk er historien om over et halvt århundredes poliovirusreplikationsundersøgelser præget af store opdagelser, hvoraf mange er opsummeret her og illustreret i fig.

Forkortelser og symboler: 3D, tredimensionelle receptorproteiner (grå cylindre, der spænder over plasmamembran) RNA, ribonukleinsyre VPg, viralt protein, genombundne (røde ovale) ribosomer (mellem blå ovale former bundet til viralt RNA) + streng RNA, positiv -sense genomisk RNA (blå vandret eller bølget linje)—streng RNA, negativ sans antigenomisk RNA (rød vandret eller bølget linje) 3D pol , viral RNA-afhængig RNA polymerase (lyserøde former) membranøse vesikler (lyseblå ovale former) Nups, nukleoporiner (orange, aflange ovale former).


Introduktion

Human norovirus (HuNV) er i øjeblikket en førende årsag til akut gastroenteritis hos voksne og forventes at blive den dominerende årsag til diarré i alle aldersgrupper på verdensplan (Patel et al., 2008 Bok og Green, 2012). HuNV kan etablere kronisk infektion og bliver livstruende hos immunkompromitterede patienter (Bok og Green, 2012). Der er dog endnu ingen effektiv antiviral eller vaccine mod HuNV, hovedsagelig på grund af manglen på en effektiv in vitro og in vivo infektionssystem af HuNV. Den seneste udvikling af udødeliggjorte B-cellelinjer, det stamcelle-afledte organoidsystem og BALB/c Rag-㬼-deficiente mus til HuNV-infektion giver nye modeller til at studere HuNV (Taube et al., 2013 Jones et al. , 2014 Ettayebi et al., 2016). Siden dens isolering fra immunkompromitterede mus (Wobus et al., 2004), har murin NoV (MNV) tjent som en effektiv surrogatmodel (Karst et al., 2003 Wobus et al., 2006) til at belyse den molekylære mekanisme for NoV-replikation og patogenese.

Norovirus (NoV) er en positiv-sense enkeltstrenget RNA (+RNA) virus, der tilhører Caliciviridae familie. 𢏇.6 kb +RNA-genomet af NoV indeholder tre åbne læserammer (ORF'er) (Hardy, 2005), med en yderligere ORF4 for MNV (McFadden et al., 2011). ORF1 koder for et polyprotein, der spaltes til ikke-strukturelle proteiner, herunder virionproteingenombundet (VPg) og RNA-afhængig RNA-polymerase (RdRp) (Sosnovtsev et al., 2006). RdRp amplificerer det virale genom ved hjælp af ribonukleotidtriphosphater (rNTP'er) som substrater i low-fidelity på grund af manglen på en effektiv korrekturlæsningsmekanisme. Starten af ​​RNA-syntese af RdRp på en RNA-skabelon kan enten være primerafhængig eller -uafhængig i Caliciviridae, Picornaviridae, og Potyviridae (Green, 2007 Goodfellow, 2011 Jiang og Laliberte, 2011). I det førstnævnte tilfælde tjener VPg som en primer for disse vira, hvilket giver frie hydroxylgrupper fra en tyrosin- eller serinrest. VPg, der er kovalent knyttet til 5′-enden af ​​virale RNA'er, spiller afgørende roller i viral proteintranslation og genomreplikation (Burroughs og Brown, 1978 Herbert et al., 1997 Goodfellow, 2011 Jiang og Laliberte, 2011).

VPg er et iboende forstyrret smeltet kuglelignende protein med flere funktioner. Det er meget forskelligartet i rækkefølge og størrelse, der spænder fra 2 til 90 kDa, hvoraf den største tilhører Birnaviridae besidder bisegmenterede dsRNA'er med dets RdRp koblet som VPg (Calvert et al., 1991). Det genomiske RNA af feline calicivirus, et medlem af Caliciviridaeer ikke infektiøs efter proteolytisk spaltning af VPg'en (Herbert et al., 1997). VPg blev vist at binde til dets beslægtede RdRp i enterovirus71 (EV71), mund- og klovsygevirus (FMDV) og coxsackievirus (CV) (Ferrer-Orta et al., 2006 Gruez et al., 2008 Chen et al., 2013 VPg af calivira ikke deler nogen sekvenshomologi. Der er endnu ingen caliciviral RdRp-VPg-kompleksstruktur tilgængelig, og rollen af ​​RdRp–VPg-interaktionen i NoV-replikation forbliver ukendt.

I denne undersøgelse karakteriserede vi nogle biokemiske og biofysiske egenskaber MNV RdRp-VPg(1-73)-komplekset. MNV VPg inducerede dannelsen af ​​højere-ordens multimerer eller rørformede fibriller af RdRp og øgede RdRp-aktiviteten. Replikationen af ​​MNV-mutanter med VPg-bindende defekte RdRps blev fuldstændig blokeret i et cellekultursystem. Desuden gav kompleksets krystalstruktur bevis for, at interaktionen mellem VPg og RdRp spiller en afgørende rolle i NoV-replikation gennem den højere ordens multimerdannelse af RdRp-molekyler.


Resultater

Karakterisering af TaV ORF-afledte konstruktioner

TaV ORF1 i fuld længde (140 kDa) fusioneret til en N-terminal hale indeholdende et hexa-histidin Tag (TaV rORF1 Fig. 1A) blev udtrykt i Hi5 insektceller inficeret med et rekombinant baculovirus, rBV-TaV ORF1. Efter ekspression blev det rekombinante protein hurtigt spaltet under frigivelse af et 75 kDa proteinfragment (fig. 1B) [13]. Massespektrometri (MALDI-TOF/TOF) viste, at dette polypeptid huser de første 674 rester af det rekombinante protein, inklusive hele RdRP-domænet (TaV)pol herfra på fig. 1A). Det sidste oprensningstrin, størrelsesudelukkelseskromatografi, viste, at TaVpol er en dimer i opløsning (fig. 1C). Denne konstruktion blev brugt til både krystallografiske analyser og funktionel karakterisering af RdRP-aktiviteten. Derudover andre proteinkonstruktioner, der huser mutationer ved det aktive sted, motiver C TaVpol(D351A/D352A) og B TaVpol(T443A/T444A) og ved de to formodede nukleotidyleringssteder, TaVpol(S4A) og TaVpol(T157A), eller deletioner ved N- og/eller C-terminalen af ​​proteinet, TaV rORF1(Δ27), TaVpol(A27-A657) og TaVpol(Δ611-617), blev også udtrykt og oprenset (fig. 1A). Det er vigtigt at bemærke, at TaV rORF1(A27)-mutantgenet resulterede i en proteinvariant, der ikke undergår en signifikant proteolytisk nedbrydning i insektceller, hvilket således muliggør oprensningen af ​​hele polypeptidet (fig. 1B). Påfaldende nok ser dette protein ud til at være en monomer i opløsning som bestemt ved analytisk størrelsesudelukkelseskromatografi (fig. 1C). Den trunkerede version TaVpol(Δ27-Δ657) er også en monomer (fig. 1C). En lille mængde oprenset TaV rORF1 i fuld længde blev opnået og anvendt i efterfølgende aktivitetsassays.

(A) Tegneserien viser skematisk proteinkonstruktioner, der er brugt i denne rapport. Den røde linje angiver det krystalliserede fragment, der indeholder RdRP-domænet (TaVpol). Polyhistidin-mærket, placeret ved N-terminalen af ​​hvert rekombinant protein, er angivet øverst. Positioner af substituerede aminosyrer i mutantproteinversioner er angivet som "*". (B) Comassie blå-farvet SDS-PAGE svarende til oprenset TaVpol og TaVrORF1(A27)-konstruktioner. Bane M svarer til molekylmassemarkører (kDa). (C) Analytisk kromatografi på en kalibreret Superdex 200 5/150 søjle af oprenset TaVpol (blå), TaV rORF1(Δ27) (rød) og TaVpol(Δ27-Δ657) (grøn).

In vitro polymeraseaktivitet af TaV rORF1 og TaVpol

Det in vitro RNA-synteseaktiviteter af TaV rORF1 i fuld længde og dets RdRP-domæne TaVpol blev først analyseret ved hjælp af en ssRNA-skabelon afledt fra den 3'-utranslaterede region (UTR) af TaV-genomet [4], hvilket viser, at begge konstruktioner er i stand til at syntetisere dsRNA fra en ssRNA-skabelon i fravær af primer, i en reaktion afhængig af Mg 2+ som katalytisk ion (fig. 2). RdRP-aktiviteten af ​​TaVpol blev også testet i nærværelse af en kort RNA-primer (8-nts) komplementær til en intern sekvens af TaV 3'-UTR, der viser ækvivalente niveauer af RNA-syntese (fig. 2A). Derudover indikerer brugen af ​​ssRNA-skabeloner af totalt heterologe sekvenser (som 3'-UTR af et nodavirusgenom Fig. 2A), at mindst in vitroTaV-enzymet kræver ikke specifikke skabelonsekvenser eller sekundære strukturer til polymerisation. RNA-polymerisationsaktivitet blev også observeret på korte RNA-skabeloner (fra 6 til 25 nukleotider), der rummer enten ikke-relaterede eller TaV 3'-UTR-afledte sekvenser (fig. 2B). Disse data illustrerer, at selvom TaVpol er i stand til at udføre de novo RNA-syntese på små ikke-specifikke skabeloner, tilstedeværelsen af ​​en guanin i 3'-enden af ​​skabelonen synes at være nødvendig for at starte reaktionen.

Repræsentative autoradiogrammer af in vitro TaV RdRP-aktivitetsassays analyseret i 7% acrylamid-TBE-geler. (A) Venstre panel, første bane, ssRNA skabelon mærket med α-32 P GTP anden og tredje linje, RdRP aktiviteter af TaV rORF1 og TaVpolhenholdsvis ved at bruge den tidligere umærkede 311-nts lange ssRNA-skabelon svarende til TaV 3'-UTR. Højre panel, polymerisationsaktivitet af TaVpol udført i: i) fravær af template (første bane), ii) tilstedeværelse af TaV 3'-UTR-templatet (anden bane), iii) tilstedeværelse af TaV 3'-UTR hybridiseret til en kort oligonukleotidprimer komplementær til en intern template sekvens (tredje bane) og iv) tilstedeværelse af en ikke-relateret viral template (3'-UTR af SJNNV nodavirus fjerde bane). (B) Polymerisationsaktivitet af TaVpol på korte ssRNA-skabeloner. Oligonukleotider på 6-, 12- og 16-nts i længden (venstre) stammer fra TaV 3'-UTR og 13- og 25-nts i længden (højre) indeholder TaV-urelaterede sekvenser. Den negative kontrol (-) blev udført i fravær af RNA. (C) Forskellige ioner (Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+, Co 2+, Ca 2+) og koncentrationer i området fra 1 til 25 mM blev anvendt i polymerisationsforsøg udført under ellers optimale betingelser (se Metoder og S1 Fig. ). En negativ kontrol (-) blev udført under anvendelse af en reaktionsblanding uden metalioner.

Ligesom resten af ​​de velkendte polymeraser, RdRP-aktiviteten af ​​TaVpol er strengt afhængig af metalioner som Mg 2+ og Mn 2+ (fig. 1C). Som beskrevet før [14-16] øger cofaktoren Mn +2 kraftigt RNA-syntese. I modsætning til hvad der blev observeret for den ikke-kanoniske IBDV RdRP [17], blev kun resterende aktivitet observeret i nærvær af 1 mM Co2+ (fig. 1C). Endvidere er erstatningen af ​​enten Mg 2+ eller Mn 2+ med andre divalente kationer, dvs.Ca2+ eller Zn2+, udøver en tydelig hæmmende virkning på RNA-syntese (fig. 1C). Polymerisationskinetikanalysen udført under optimale betingelser for dette enzym (1,3 mM RdRP i 50 mM MES pH 6, 150 mM NaCl og 5 mM MgCl2 ved 35°C S1 Fig) viser en sigmoid profil med et indledende trin med lav RNA-syntese og en sluttilstand af mætning (S2 Fig).

Strukturen af ​​TaVpol

Strukturen af ​​TaVpol blev løst ved SAD-metoder fra Lu 3+ derivat co-krystaller til 3,0 Å opløsning (tabel 1) [13]. Native data blev derefter brugt til at færdiggøre og forfine modellen til en endelig opløsning på 2,15 Å (tabel 1). Den asymmetriske krystalenhed omfatter en tætpakket polymerasedimer indeholdende 1.326 rester: fra P10 til K672 af molekyle A og fra P10 til E674 af molekyle B. Monomerer A og B er næsten identiske med en rms-afvigelse på 0,27 Å for overlejringen af ​​alle rester. Hver monomer består af en kugleformet RdRP-kerne (resterne 41-648) og to terminale arme (resterne 10-40 og 649-674), der strækker sig ud af kernen og er involveret i en række intermolekylære interaktioner, der stabiliserer den dimere struktur (fig. 3). RdRP-kernen anvender den klassiske lukkede "højrehånds"-arkitektur bestående af fingre (helixer α3-α13 og α15-α16 aminosyrer 41-303 og 375-443), palme (α14, β6-β8 304-374 og α17-α18) , β9-β10 444-519) og tommelfinger (α19-α24 520-649) underdomæner, der omkranser de syv bevarede motiver (A til G), der kræves til substratgenkendelse og katalyse (Fig. 4A). Som forventet fra tidligere bioinformatiske forudsigelser [3,4], viser strukturelle sammenligninger ved hjælp af Dali [18] vigtige ligheder mellem TaVpol og birnaviruspolymeraser. De højeste hits blev opnået med IPNV (PDB id 2YIB) og IBDV (PDB id 2QJ1) RdRP'er, som viste Z-score på 25,4 og 21,9 og r.m.s afvigelser på 3,1 og 2,9 Å for overlejring af henholdsvis 523 og 524 rester. Desuden blev der også observeret uventede og slående ligheder, når den samlede TaVpol arkitektur blev sammenlignet med forskellige medlemmer af Flaviviridae familie, med Z-score på 16,1 (japansk encephalitisvirus PDB id 4K6M), 13,8 (DV PDB id 4V0R) og 13,8 (HCV PDB id 2XIZ) med rms-afvigelser på 3,3, 3,3 og 3,4 Å for overlejringen af ​​444,8, 330 rester hhv. Lignende resultater blev opnået, når de individuelle underdomæner blev overlejret (S3 Fig.).

(A) De to molekyler i den krystalasymmetriske enhed er vist som bånd i henholdsvis blåt og hvede. Aminosyrer ved de N- og C-terminale ender opretholder den dimere struktur af enzymet. Den nederste indsats viser in vitro polymerisationsassays, der viser, at deletion af de første 27 N-terminale aminosyrerester øger enzymatisk aktivitet. (B) Nærbillede af interaktioner etableret mellem N-terminalen af ​​molekylet B (blå) med det centrale hulrum af molekyle A (hvede). De første ni proteinrester er uordnede og ikke synlige i elektrontætheden. Den første synlige rest, P10, er placeret på 18 Å af det aktive sted. (C) Nærbillede af interaktioner etableret mellem C-terminalen af ​​molekyle B med fingrenes domæne af molekyle A. I panel B og C er sidekæderne af rester involveret i intermolekylære interaktioner afbildet som sticks og eksplicit mærket. På grund af tilstedeværelsen af ​​den ikke-krystallografiske symmetri (ncs) er dyad-interaktioner mellem N- og C-terminalen af ​​molekyle A med molekyle B og dem af N- og C-terminalen af ​​molekyle B med molekyle A identiske.

(A) Bånddiagram af TaV-enzymet, der viser den typiske lukkede højrehåndsarkitektur, som omkranser de syv bevarede sekvensmotiver (A, Rød B, grøn C, Orange D, violet E, gul F, cyan G, pink). De sekundære strukturelle elementer såvel som de N- og C-terminale ender af enzymet er mærket. Den lange λ6-løkke, som delvist okkluderer det centrale hulrum af enzymet, er fremhævet med mørkeblåt. De to asparaginsyrerester af motiv C (D351 og D352) og motiv A (D369 og D374) er vist som pinde. Skemaet (nederste panel) viser den permuterede organisation af TaV-palmedomænet. (B) Nærbillede af λ6-løkken med de to aromatiske sidekæder, Y611 og F613, vist som pinde og mærket. Strukturerne af de tilsvarende løkker i to forskellige medlemmer af Flaviridae familie, HCV (grøn) og DV (orange) er overlejret. HCV-primerbindingsresten Y448, der er ansvarlig for interaktionen med det første nukleotid, der er tilføjet til den nyligt syntetiserede RNA-kæde [19], er placeret tæt på F613 i TaV og til H798 i DV. (C) Autoradiografier af in vitro TaV RdRP-aktivitet, analyseret i 7% acrylamid-TBE-geler, der viser, at mutationer i motiv C-rester D351 og D352 ophæver RNA-syntese (øverst), og at eliminering af spidsen af ​​λ6 (rest 611-617) øger RNA-polymerisering (nederst).

Det formodede VPg-signal (rest 153-165) er placeret ved pegefingeren (PV-nomenklatur [20]), og dækker α5-α6-forbindelsen og α6 N-terminalen (fig. 4A). Strukturen af ​​dette motiv ser ud til at være tæt forbundet med dets birnavirus-modstykke (fig. 5A) [9-11]. Opstrøms for dette motiv bidrager tre helixer (α3-α5) også til, at pegefingeren krydser håndfladens underdomæne for at interagere med tommelfingeren og lukker højre hånds struktur (S4 Fig.). Endelig er α3 forbundet med en lang løkke til de N-terminale helixer α2 og α1, der strækker sig uden for polymerasekernen. Store strukturelle forskelle observeres i denne N-terminale region, når birnavirus og permutatetravirus sammenlignes (fig. 5A). Selvnukleotidyleringsaktiviteten af ​​TaV-enzymet blev analyseret in vitro bruger både TaVpol og TaVrORF1-konstruktioner i nærvær af den TaV-afledte ssRNA-skabelon beskrevet ovenfor. Auto-nukleotidilation af TaVpol er ikke blevet detekteret (fig. 5B). Derudover er TaVpol(T157A) og TaVpol(S4A) mutanter, hvor de forudsagte nukleotidyleringsrester [4, 11] blev erstattet af alanin, opretholder niveauer af RNA-syntese svarende til dem, der er påvist med vildtype-enzymet i in vitro polymerisationsassays (S5 Fig.). Kun TaV rORF1 i fuld længde bevarer det radioaktive α-32P GTP-signal (fig. 5B). Selvom der kræves flere eksperimenter for præcist at kortlægge guanyleringsstedet, indikerer denne observation, at TaV ORF1 C-terminalen er essentiel for selvnukleotidylering.

(A) Strukturel overlejring af TaV-polymerase N-terminus (guld) med de ækvivalente rester i IBDV RdRP (grøn). De strengt bevarede rester i VPg-signaturen er vist som sticks og mærket. (B) Autoradiograf af in vitro selv-guanyleringsaktiviteter af TaVpol og TaV rORF1 analyserede 11 % SDS-PAGE (øverst). Geler blev også farvet med Coomassie-blåt for at vurdere proteinbelastning (nederst). Positionen af ​​molekylmassemarkører (M) er angivet (kDa) ved den nederste gel.

C-A-B-permutationen af ​​TaVpol palme, med GDD-motivet (resterne 350-352), placeret ved β6-β7-hårnålen, og motiv A-resterne D369 og D374, der ligger for enden af ​​streng β8, er rumligt kompatibel med en kanonisk organisation af det aktive sted (fig. 4A). Lignende palmearkitekturer blev fundet i RdRP-strukturerne af birnavirus [9-11].

Den spiralformede tommelfinger af TaVpol er større end tommelfingerdomænerne af andre ssRNA RdRP'er, der vides at initiere replikation på en primerafhængig måde som picorna- og caliciviruspolymeraser [2,21]. Derudover er TaVpol tommelfingeren har en lang sløjfe (λ6 rester 591-625), der rager ud i det centrale hulrum, der strukturelt svarer til priming-løkkerne af flavivirus og bakteriofag ϕ6 [21-24] (Fig. 4B). Strukturelle sammenligninger viser, at λ6-løkken, der forbinder helixerne α20 og α22, stammer fra den samme del af tommelfingerens underdomæne som for flaviriruses DV og West Nile Virus (WNV), men er større og indeholder to sekundære strukturelle elementer i sin N-terminal: kort α21- og den ene tur 310 η8-helixer (fig. 4A og 4B). Placeringen af ​​dette element stabiliseres af interaktioner etableret mellem forskellige α21-rester, som kommer i kontakt med α1-helixen ved polymerase N-terminalen, og mellem spidsen af ​​løkken (resterne 613-616) med resterne 301-304 og 317-320 i helix α12 og løkken α12-α13, henholdsvis.

For yderligere at undersøge λ6-løkkens rolle i TaV RdRP-aktivitet genererede vi en deletionsmutant, TaVpol(Δ611-617), forventes at vise et åbent aktivt sted, der mangler den formodede priming platform, som understøtter rNTP primeren under de novo initiering, men det kan til gengæld begunstige akkommodationen af ​​det nyligt syntetiserede dsRNA under forlængelse. RNA-forlængelseaktiviteten blev derefter testet under anvendelse af RNA-skabelonen afledt af TaV 3'-UTR. Analyse af reaktionsprodukter på denaturerende polyacrylamidgeler viste en øget aktivitet af TaVpol(Δ611-617) mutant på denne skabelon sammenlignet med det originale enzym (fig. 4C). Sammenlignelige øgede aktiviteter blev også observeret efter lignende deletioner inden for de ækvivalente primingsløkker af HCV og DV RdRP'er [25,26]. Da den lange ssRNA-skabelon, der anvendes i disse assays, er i stand til at danne en fork-by-base-komplementaritet, der kan placeres i det centrale RdRP-hulrum, ville de observerede forlængelsesprodukter af denne mutant blive genereret ved back-primet RNA-syntese. Til støtte for denne fortolkning er de novo RNA-syntese på korte oligonukleotid-skabeloner er afskaffet i TaVpol(Δ611-617) mutant (S6 Fig.).

Dimerisk organisation af TaVpol

Begge polymerasemolekyler i den asymmetriske enhed associerer i en pseudo-dobbelt molekylær akse. Kontaktfladen mellem disse to molekyler, beregnet ved hjælp af PISA-programmet [27], viser et samlet areal på 6.038 Å 2 (

11% af dens samlede overflade) og forudsiger en dimer stabiliserende energi på ΔGdiss = 46,3 kcal/mol. Interaktionens grænseflade involverer: (i) N-terminalen af ​​et molekyle, der kommer i kontakt med det aktive steds hulrum af den anden polymerase, og (ii) den C-terminale ende af et molekyle, der kommer i kontakt med de øverste fingre på det andet (fig. 3) .

Interaktioner medieret af polymerase N-terminalen involverer den synlige del af den N-terminale ende (resterne 10-14) og helix α1 (resterne 15-29), der strækker sig mod det centrale hulrum af nabomolekylet (dyadrelateret), og kontakter fingerspiralen α8 (rester 205-207) og α8-α9-løkken (208-225). De intermolekylære interaktioner er hovedsageligt hovedkæde-hovedkæde-hydrogenbindinger, men inkluderer også en saltbro mellem R37 og D101 (β3). Den første synlige rest i elektrontætheden (P10) optager bunden af ​​skabelonkanalen, ved omtrent den forventede position af det første skabelonnukleotid, i tæt kontakt med resterne 209-211 (fig. 3B). Disse kontakter involverer i alt 38 rester, der dækker en overflade på 2.725 Å 2 med en energi ΔGdiss = 16,5 kcal/mol. Ækvivalente krystaller er blevet opnået efter den enzymatiske spaltning af det N-terminale hexa-histidinmærke. Desværre afslørede den resulterende struktur ikke yderligere information om placeringen af ​​de første ni proteinrester.

For at udforske den funktionelle rolle af polymerase N-terminalen i tæt kontakt med skabelonkanalen af ​​det tilstødende enzym, designede vi en TaV rORF1 mutant, TaV rORF1 (Δ27), der mangler de første 27 N-terminale rester (fig. 1) . Overraskende nok gennemgår TaV rORF1(A27) ikke spaltningen i 75 kDa polypeptidet observeret i fuldlængdeproteinet, og det er desuden organiseret som en monomer i opløsning (fig. 1C). Polymerisationsassays udført med denne mutant såvel som med TaVpol(Δ27-Δ657)-konstruktion viser, at elimineringen af ​​de første 27 rester, der forhindrer dimerdannelse, også forårsager en signifikant stigning i RNA-syntese (fig. 3A, bundindsats og S7).

TaVpol C-terminalen er dannet af en lang arm (rester 649-674), der strækker sig langs fingerspiralerne α8, α9 og α14 ved den ydre overflade af proteinet (fig. 3C). De C-terminal-medierede interaktioner omfatter 43 rester, der danner en kontaktflade på 3.313 Å2 med en ΔGdiss = 17,2 kcal/mol.

TaVpol dimerer blev også observeret ved negativ farvningstransmissionselektronmikroskopi (S8 Fig), hvilket indikerer, at dimerstrukturen, først observeret i krystaller, er stabil i opløsning og opretholdt selv ved meget lave proteinkoncentrationer.

Struktur af TaVpol i kompleks med en ssRNA-skabelon og indkommende rNTP'er

TaVpol-ssRNA-rNTP komplekse co-krystaller blev opnået efter inkubation af TaVpol med oligonukleotidskabelonen 5'-CCCAUUCGACUCCUG, ATP, CTP og MnCl2. Dette kompleks krystalliserede i rumgruppen I222 med en TaVpol dimer i den asymmetriske enhed. Strukturen blev løst ved molekylær erstatning og forfinet til 3,5 Å opløsning (tabel 1). Strukturelle sammenligninger mellem ubundne og ssRNA-rNTP-bundne enzymer afslørede to væsentlige konformationelle ændringer: (i) en ∼7˚ rotation af en monomer i forhold til den anden i dimeren og (ii) en konformationel omlejring af polymerase N-terminalen, resulterer i en subtil åbning af det centrale hulrum, der letter skabelonindtastning (S9 Fig.).

Den strukturelle analyse af dette kompleks afslørede tilstedeværelsen af ​​en ekstra tæthed ved det aktive polymerasested i et af de to molekyler i den krystalasymmetriske enhed (molekyle B). Denne tæthed blev fortolket som tilstedeværelsen af ​​et bundet ATP-molekyle, med ATP-basen tæt stablet til resterne Y611 og F613 i loop λ6 og triphosphatdelen, der optager nukleotidindgangstunnelen, i kontakt med de grundlæggende rester R280, K278 af motiv F og K488. af motiv D (fig. 6A og 6B).

(A) Placering af de to bindingssteder for indkommende rNTP-molekyler fundet i de forskellige krystalstrukturer. Motiv C er fremhævet med orange med de katalytiske rester D351 og D352 vist som pinde. (B) Nærbillede af ATP-molekylet bundet til TaVpol aktivt sted med adeninbasen fast stablet på Y611- og F613-resterne i primingsløkken λ6 (blå). Ribosedelen interagerer med den katalytiske D351-rest af motiv C (orange), og trifosfatet er involveret i saltbroer med K278 og R280 i fingrenes motiv F (cyan) og K448 af motiv D. 2Fo-Fc-elektrondensitetskortet ca. ATP-molekylet vises ved en kontur på 1σ (grønt net). (C) Uventet bindingssted for et CTP-nukleotid i tommelfingerdomænet af TaVpol. 2Fo-Fc elektrondensitetskortet (1σ) er vist som et grønt net. En yderligere stærk top af elektrondensitet, fundet i nærheden af ​​NTP-bindingsstedet, blev fortolket ved tilstedeværelsen af ​​en sulfation fra krystallisationsopløsningen. Dette sulfat ser ud til at være tæt bundet til sidekæderne af tre R-rester.

Desværre var elektrondensiteten svarende til ssRNA-skabelonen for svag og diskontinuerlig til at tillade opbygningen af ​​en nøjagtig model. Imidlertid blev stærke toppe detekteret langs skabelonkanalen af ​​polymerasen, der ville svare til fosfatdelene af oligonukleotidet bundet i en lignende orientering som den af ​​skabeloner afledt af overlejring af tilgængelige RdRP-ssRNA-komplekser på TaV-enzymet (S10 Fig.) .

Ydermere blev en yderligere top af elektrontæthed også set i tæt kontakt med motiv B-resterne T443 og T444, langt fra banen for den formodede template-phosphodiester-kæde (S10 Fig.). Røntgenanalyse af en anden TaVpol-ssRNA-kompleks indikerede, at denne densitet ville svare til skabelonbasen i position 3', der overskrider dets forudsagte bindingssted foran det indkommende rNTP, hvilket ser ud til at være tæt pakket til disse motiv B-rester. Desværre kunne kun et delvist datasæt indsamles fra disse krystaller (53,8% fuldstændighed til 3,1 Å opløsning S10 Fig.). Motiv B indeholder et antal S/T-rester strengt konserveret i RdRP'er, der er involveret i skabelonbinding og translokation af det nyligt syntetiserede dsRNA [28-29]. TaVpol-RNA-kompleks tyder på, at disse motiv B-rester også kan tjene som et bindingssted for den terminale base af skabelonen i et præ-initieringstrin. For at vurdere rollen af ​​disse konserverede rester på RNA-syntese blev T443 og T444 erstattet med Ala. RdRP-aktiviteten af ​​det mutante enzym blev analyseret in vitro, hvilket viser, at T→A erstatter ved position 443 og 444 i TaVpol fuldstændigt afskaffe RNA-syntese (S10 Fig).

Et usædvanligt nukleotidbindingssted i tommelfingerdomænet af TaV RdRP

TaVpol-GTP og TaVpol-CTP co-krystaller blev også opnået i nærvær af MgCl2 og de tilsvarende strukturer løst til henholdsvis 2,3 Å og 2,25 Å opløsning (tabel 1). I begge tilfælde blev der observeret klare elektrondensiteter for triphosphatdelene, der interagerer med elektropositive rester ved rNTP-tunnelen. Imidlertid var de tilsvarende nukleosiddele uordnede. Derudover afslørede disse strukturer et andet nukleotidbindingssted i en fuldstændig uventet region, et hulrum inde i tommelfingerens underdomæne, omkring 30 Å fra det aktive sted (fig. 6C). I denne position kommer nukleosiddelene af de bundne NTP'er i kontakt med resterne M556, T560 og D563 fra α19-helixen og til E601 fra λ6 N-terminalen, hvorimod triphosphatdelene forbliver delvist udsat for opløsningsmidlet, og de ser for det meste uordnede ud. Det skal bemærkes, at nukleotiderne er bundet ved siden af ​​en stærk elektropositiv region, resterne R564, R545 og R269, der også indeholder en ekstra tæthedstop, fortolket som et sulfatmolekyle afledt af krystallisationsopløsningen (fig. 6C). Bemærkelsesværdigt er dette sulfat til stede i alle andre analyserede TaVpol strukturer.


Resultater og diskussion

For at identificere VPg unlinkase udviklede vi en flertrins oprensningsprocedure ved hjælp af vores nyligt beskrevne VPg unlinkase aktivitetsassay, som løser [35S]methionin radiomærket-VPg frigivet fra poliovirus vRNA (35 S-PV1-RNA) af Tris-tricin SDS/ SIDE (7). Vores assay var optimeret til hurtig påvisning af VPg unlinkase aktivitet (Materialer og metoder). Under udviklingen af ​​dette oprensningsskema screenede vi forskellige syntetiske forbindelser og nukleinsyrer som konkurrerende inhibitorer, der skal bruges til affinitetsoprensning af VPg unlinkase. Vi lavede en tilfældig observation, at enkeltstrenget DNA (ssDNA) er ~100 gange mere effektivt til at hæmme VPg-unlinkaseaktivitet end syntetisk RNA med eller uden en 5'-tyrosyl-RNA-binding (fig. S1). Dette nøglefund fik os til at inkludere ssDNA-cellulose i vores oprensningsprotokol.

Fordi VPg-unlinkase-aktivitet findes i både cytoplasmatiske og nukleare ekstrakter (2), påbegyndte vi vores oprensningsprocedure ved at bruge totalt cellehomogenat fra uinficerede HeLa-celler. Efter at have udsat homogenatet for højhastighedscentrifugering for pelletcelleaffald og store komplekser indeholdende nukleinsyrebindende proteiner, blev supernatanten (S370), som indeholdt ~75% af den oprindelige aktivitet, fraktioneret sekventielt af heparin-sepharose, ssDNA- cellulose-, anionbytnings-, størrelsesudelukkelses- og kationbytterkromatografi, hvilket resulterer i dannelsen af ​​et næsten homogent enzympræparat, hvor aktiviteten blev beriget med >10.000 gange (fig. 1) B og C). Det resulterende 38-kDa polypeptid (p38) isoleret ved dette oprensningsskema (fig. 1B, bane 7, oprensningstrin F) svarede i størrelse til VPg-unlinkase påvist under vores indledende karakterisering af denne aktivitet (fig. S2). Analyse af fraktioner fra oprensningstrin F (kationbytningskromatografi) bekræftede coelueringen af ​​p38 (fig. 2)EN, Nederste) med VPg-unlinkase-aktivitet (fig. 2EN, Øverst og Fig. S3).

Identifikation af p38 som TDP2. (EN) Kvantificeret VPg unlinkase aktivitetsprofil (Øverst, rødt histogram) og SDS/PAGE-analyse (Nederste) af fraktioner genereret ved oprensningstrin F viser coelueringen af ​​p38 med VPg-unlinkaseaktivitet. Diagonal linje (brun) angiver den lineære gradient af stigende NaCl-koncentration (~150 til 350 mM) anvendt til at eluere VPg unlinkase. (B) Massespektrometrianalyse af p38 isoleret fra bane 7 (p38-F12, Øverst) og bane 8 (p38-F13, Nederste) af polyacrylamidgelen vist i EN, Nederste identificerede adskillige tryptiske peptider svarende til TDP2 (i rødt er overlappende sekvens understreget). (C) Western blot-analyse ved anvendelse af anti-TDP2 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology) bekræfter isoleringen af ​​TDP2 ved vores oprensningsprotokol (baner mærket ved oprensningstrin). (D) Relative TDP2-ekspressionsniveauer i forskellige cellulære ekstrakter korrelerer med den tidligere detekterede VPg-unlinkase-aktivitet (7): HeLa (human cervikal carcinomcellelinje) > K562 (human myeloid leukæmicellelinje) > NGP (human neuroblastomcellelinje) > SKOV3 (human ovariecarcinomcellelinje) > RRL (kanin retikulocytlysat).

Proteinet svarende til p38 blev skåret ud fra to forskellige baner af en polyacrylamidgel (fig. 2)EN, bane 7 og 8, Nederste) svarende til elueringsfraktionerne F12 og F13 i aktivitetsprofilen (fig. 2)EN, Øverst) og udsat for trypsinfordøjelse efterfulgt af nano-væskekromatografi (nano-LC) MS/MS-analyse. Denne analyse identificerede utvetydigt p38 som TDP2 via unikke peptider fremhævet i fig.B, Øverst og Nederste. TDP2 er en Mg2+/Mn2+-afhængig cellulær hydrolase, der vides at spalte 5'-tyrosyl-DNA-bindingen genereret som et resultat af topoisomerase-medieret DNA-skade (10). Dette protein er også kendt som TTRAP og EAPII og har vist sig at fungere i transkriptionel regulering, signaltransduktion og protein-protein-interaktioner forbundet med mulige roller i neuronal udvikling og cancerprogression (11). Derudover findes TDP2 i både kernen og cytoplasmaet af pattedyrceller (11), i overensstemmelse med den oprindelige rapport om VPg-unlinkase-aktivitet af Ambros et al. (2).

Vi verificerede tilstedeværelsen af ​​TDP2 i de forskellige fraktioner (A til F) genereret af vores oprensningsskema (fig. 1) B og C) ved Western blot-analyse under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt polyklonalt antistof (fig. 2C). For at vurdere korrelationen mellem TDP2- og VPg-unlinkase-aktivitet bestemte vi, om TDP2-ekspressionsniveauer i forskellige celler korrelerede med deres VPg-unlinkase-aktivitet. Den observerede ekspressionsprofil af TDP2 ved Western blot-analyse (fig. 2D) var i overensstemmelse med den relative overflod af VPg-unlinkase-aktivitet rapporteret tidligere (figur 5 i ref. 7) for ekstrakter fra følgende celler (fra højeste til laveste aktivitet): HeLa (human cervikal carcinomcellelinje) > K562 (human myeloid leukæmicelle) linje) > NGP (human neuroblastomcellelinje) > SKOV3 (human ovariecarcinomcellelinje) > RRL (kanin retikulocytlysat). Det skal bemærkes, at vi påviste næsten ingen TDP2- eller VPg-unlinkase-aktivitet i kommercielle præparater af RRL, hvorimod tidligere undersøgelser havde rapporteret VPg-frakoblingsaktivitet i RRL (2, 6, 12). Selvom vi ikke kender årsagen til denne tilsyneladende uoverensstemmelse, tillader vores observationer os at konkludere, at TDP2-ekspressionsniveauer korrelerer med niveauer af VPg-unlinkase-aktivitet.

For at bekræfte, at TDP2 har autentisk VPg-unlinkase-aktivitet, rensede vi rekombinant GST-mærket TDP2 fra Escherichia coli og analyseret for VPg-unlinkase-aktivitet. Når [35S]VPg-mærket virion-RNA ([35S]VPg-PV-RNA) isoleret fra oprenset poliovirus blev inkuberet med GST-TDP2 eller delvist oprenset VPg-unlinkase, blev afkoblingen af ​​VPg observeret (fig. 3)EN, Øverst). Analyse af disse reaktioner med 1 % (vægt/vol) agarosegelelektroforese bekræftede, at frigivelsen af ​​VPg fra vRNA ikke skyldtes RNA-nedbrydning (fig. 3)EN, Nederste). Vi har tidligere rapporteret, at VPg-unlinkase kan fjerne VPg fra forskellige picornavirus VPg-RNA-substrater (7), derfor inkuberede vi GST-TDP2 med [35S]VPg-PV RNA eller [35S]methionin radioaktivt mærket-humant rhinovirus 14 VPg knyttet til en poliovirus-rhinovirus kimært RNA (7) ([35 S]VPg HRV-PV RNA). GST-TDP2, men ikke GST alene, var i stand til at fjerne VPg fra begge VPg-RNA-substrater (fig. 3)B). De elektroforetiske migrationsprofiler af VPg genereret af GST-TDP2 eller delvist oprenset VPg unlinkase var identiske, men adskilt fra den langsommere migration af VPg-pUp, som produceres af den totale nedbrydning af vRNA ved hjælp af RNase A (sammenlign bane 2-5 med bane 6 og bane 9–12 til bane 13 i fig. 3B). Disse resultater viser, at TDP2 har autentisk VPg-unlinkase-aktivitet.

Rekombinant GST-TDP2 har autentisk VPg-unlinkase-aktivitet. (EN) Ækvivalente mængder af delvist oprenset VPg-unlinkase og GST-TDP2, begge ubundne VPg fra [35S]VPg-PV RNA (Øverst), uden nogen tilsyneladende nedbrydning af PV RNA (Nederste). (B) Stigende mængder af delvist oprenset VPg-unlinkase og GST-TDP2, men ikke GST, ikke-bundet VPg fra [35S]VPg-PV-RNA og [35S]VPg-HRV-PV-RNA. Reaktioner indeholdende RNase A blev inkluderet for at generere markører for VPg-pUp (bane 6 og 13).

For at undersøge den eller de potentielle mekanismer, hvorved picornavirus beskytter VPg-RNA-bindingen af ​​afkoms-RNA under replikation og indkapsling, brugte vi konfokal mikroskopi til at bestemme den subcellulære lokalisering af TDP2 og virale proteiner forbundet med RNA-syntese (3A) eller indkapsling (kapsid) proteiner) i løbet af poliovirusinfektion. HeLa-celler blev falsk inficeret eller inficeret med poliovirus, og celler blev fikseret og behandlet til billeddannelse som beskrevet i Materialer og metoder. Vist i fig. 4 er repræsentative billeder af mock- og poliovirus-inficerede celler 2 eller 4 timer efter infektion. TDP2 var overvejende lokaliseret i kernen af ​​mock-inficerede celler, med nogen lavere intensitetsfarvning i cytoplasmaet og var noget mere spredt i cellekernen og cytoplasmaet 2 timer efter infektion. I modsætning hertil viste TDP2 4 timer efter infektion et slående subcellulært distributionsmønster og så ud til at være sekvestreret til specifikke områder af kernen og til periferien af ​​cytoplasmaet. Derudover observerede vi regioner i cytoplasmaet af celler 4 timer efter infektion, der stort set var blottet for TDP2 (markeret med stiplede pile), mens de indeholdt det virale protein 3A (fig. 4)EN) og virale capsidproteiner (fig. 4B). I periferien af ​​den inficerede celle blev TDP2-, 3A- og capsidproteiner fundet i umiddelbar nærhed af hinanden, men de så ikke ud til at kolokalisere (bekræftet af z-stakanalyse). Fra ændringerne i den subcellulære lokalisering af TDP2, der forekommer på senere tidspunkter efter infektion, foreslår vi, at picornavira udelukker TDP2 fra RNA-replikationskomplekser for at beskytte VPg-koblede afkom-RNA'er, der kræves til indkapsling.

Poliovirusinfektion relokaliserer TDP2. (EN) Immunfluorescens af TDP2 og viralt RNA-replikationsprotein 3A. Håne- (Top) eller poliovirus-inficerede HeLa-celler blev fikseret på bestemte tidspunkter efter infektion, vist er billeder genereret efter 2 timer (Midten) eller 4 timer (Bund) efter infektion. Celler blev kolmærket med antistoffer rettet mod TDP2 (vist med rødt) eller poliovirusprotein 3A (grønt), og kerner blev farvet med DAPI. Stiplede pile angiver områder, der stort set var blottet for TDP2. Pile angiver regioner af poliovirus 3A, der støder op til regioner af TDP2. (B) Immunfluorescens af TDP2 og capsidproteiner. Håne- (Top) eller poliovirus-inficerede HeLa-celler blev fremstillet som beskrevet i EN ovenfor, bortset fra at celler blev kolmærket med anti-TDP2 eller poliovirus anti-capsid antistoffer. Stiplede pile angiver områder, der stort set var blottet for TDP2. Pile angiver regioner af virale capsidproteiner fundet ved siden af ​​regioner af TDP2.

Selvom TDP2 er den eneste kendte 5'-tyrosyl-DNA-phosphodiesterase fundet i hvirveldyrceller (13), blev den oprindeligt ignoreret som en formodet VPg-unlinkase-kandidat af flere årsager. For det første er det blevet rapporteret, at VPg-unlinkase ikke kan spalte tyrosyl-nukleinsyrebindingen af ​​et syntetisk 5'-tyrosyl-DNA-substrat (14). I et forsøg på at forstå, hvorfor VPg-unlinkase heller ikke er i stand til at hydrolysere serin-RNA-bindingen af ​​det genom-koblede protein fra cowpea mosaic virus (15, 16), overvejede vi muligheden for, at elektrostatiske interaktioner med tyrosin (bundet til genomisk RNA) ) er vigtige determinanter for substratgenkendelse af VPg unlinkase, svarende til de mekanismer, der anvendes af apurin/apyrimidinisk endonuklease (17), cap-bindende proteiner (18) og en lang række andre protein-ligand-interaktioner (gennemgået i ref. 19) . Denne model forudsiger, at det 3,5-[125I]diiodotyrosin-mærkede syntetiske 5'-tyrosyl-DNA-substrat anvendt i det ovennævnte arbejde er uforeneligt med det aktive sted for VPg-unlinkase. For det andet havde massespektrometrianalyse af fraktioner indeholdende VPg-unlinkase genereret af tidligere oprensningsprotokoller ikke påvist TDP2 (7). I betragtning af, at TDP2 er et hurtigt (20) og lavt indholdsenzym (21), er det sandsynligt, at proteinrenhed i forhold til TDP2-overflod var utilstrækkelig til identifikation i disse fraktioner. For det tredje korrelerede molekylvægten af ​​fuldlængde TDP2 ikke med nogen af ​​de tidligere rapporterede molekylvægte for VPg unlinkase [~27 kDa (3) og 24-30 kDa (22)]. Selvom dette er sandt for de fremherskende former for TDP2, der er beskrevet i litteraturen (gennemgået i ref. 11), har vi opdaget mindst tre former for TDP2 med tilsyneladende molekylmasser fra 26 til 50 kDa (fig. S4)B). Alle tre former for TDP2 coeluerede med den tilsvarende art af VPg-unlinkase-aktivitet påvist i råekstrakt (fig. S4)EN). Fordi phosphodiesterase-domænet af TDP2 er inden for den C-terminale del af dette protein (23), forudsiger vi, at tidligere grupper kan have delvist oprenset en trunkeret form af TDP2.

I øjeblikket er den funktionelle rolle af TDP2, hvis nogen, under en picornavirusinfektion uklar. Det er blevet foreslået, at VPg-unlinkase-aktivitet er involveret i modningen af ​​picornavirus-vRNA til mRNA'er forbundet med translaterende polyribosomer (2, 3, 8), muligvis som en forudsætning for intern ribosom-indgangssted-medieret translationsinitiering. En yderligere regulerende rolle for afkoblingen af ​​VPg af TDP2 kan forekomme på niveauet af vRNA-indkapsling (6, 9, 12). Fordi kun VPg-bundet RNA er indkapslet, kan TDP2 være påkrævet for at stimulere effektiv viral RNA-replikation ved at hæmme for tidlig vRNA-pakning. Fordi niveauerne af VPg-unlinkase-aktivitet ikke ser ud til at ændre sig under poliovirusinfektion (7), tyder dette scenarie på, at TDP2 og virale proteiner involveret i vRNA-pakning konkurrerer om begyndende vRNA'er. I betragtning af de genetiske og biokemiske beviser for, at picornavirus-RNA-replikation og indkapsling er koblet (24, 25), kan TDP2 blive blokeret eller sekvestreret fra begyndende vRNA'er, efter at tilstrækkelige niveauer af virale proteiner er akkumuleret, hvilket resulterer i øget produktion af afkomsvirioner. Dette mulige scenarie, understøttet af vores konfokale billeddannelsesdata, vises i modellen vist i fig. 5. Implicit i vores model er forudsigelsen, at virusinfektion modulerer aktiviteten eller cellulære placering af TDP2/VPg unlinkase for at begrænse dens adgang til virale RNA'er sent i den smitsomme cyklus. Det vil være nødvendigt at udføre picornavirusinfektioner i cellekultur i fravær af TDP2 (efter RNAi-knockdown eller genetisk ablation) for at afgøre, om der er en resulterende reduktion i niveauerne af viral RNA-replikation (og i sidste ende i virusudbytter) pga. den for tidlige pakning af vRNA'er eller til ineffektiv translationsinitiering ved begyndelsen af ​​infektion. Denne forudsigelse, hvis den er sand, ville gøre VPg-unlinkase-aktiviteten af ​​TDP2 til et attraktivt mål for antivirale terapier, der sigter mod at reducere virusbelastningen hos individer inficeret med picornavirus såsom human rhinovirus eller enterovirus 71 (EV71), især i betragtning af morbiditeten hos spædbørn og børn inficeret med disse vira (26, 27). En advarsel til TDP2 som et terapeutisk mål til at kontrollere picornavirusinfektioner er de potentielle toksiske virkninger, som sådanne behandlinger kan have på celler, givet de normale roller, som dette protein spiller i DNA-reparation og cellulær signalering. Det kan dog være muligt at designe små molekylehæmmere, der målretter mod den mekanisme, der bruges af virussen til at kapre TDP2 uden at påvirke dets cellulære funktion.

TDP2-sekvestration-afkom vRNA-afskærmningsmodel. (EN) VPg-RNA-kobling af virion-RNA (vRNA) efter dets frigivelse fra et inficerende virion spaltes af TDP2 (gult "pac-man"-symbol), som genererer viralt mRNA og frit VPg (grøn kugle). Efter translation bruges det virale mRNA som skabelon for (−) streng RNA-syntese af den virale polymerase (3D pol ) (orange ovaler). (−)-streng-RNA'et bruges derefter af 3D-polen som en skabelon i (+)-streng-RNA-syntese til at generere vRNA, som enten er indkapslet eller ikke-linket for at deltage i viral translation og RNA-replikation. (B) Under det sene stadie af replikationscyklussen udelukkes TDP2 fra sites for viral RNA-syntese og indkapsling, hvilket muliggør generering af afkomsvirioner.

Sammenfattende tyder vores resultater på en løsning på et værtspatogen-mysterium, der havde været uhåndgribeligt i over tre årtier. Så vidt vi ved, er TDP2-enzymet unikt ved at blive tilskrevet en 5'-tyrosyl-RNA-phosphodiesterase-aktivitet. Pattedyrenzymet, der er i stand til 3'-tyrosyl-DNA-phosphodiesteraseaktivitet (Tdp1), har en begrænset 3'-nukleosidaseaktivitet, der er i stand til at virke på både DNA- og RNA-substrater (28). Men til dato er dette enzym ikke blevet rapporteret at spalte tyrosyl-RNA-bindinger. Den unikke aktivitet af TDP2 til at hydrolysere både tyrosyl-RNA og tyrosyl-DNA-bindinger kan til dels være en konsekvens af lighederne, der deles af DNA og RNA. Det kan også være en konsekvens af udviklingen af ​​biokemiske veje ved hjælp af TDP2-lignende enzymer til reparation eller funktionel regulering af unikke protein-nukleinsyrearter. TDP2's evne til at hydrolysere virale protein-RNA-bindinger kan være det tilbageværende spor til et forfædres enzym i RNA-verdenen, der i løbet af evolutionen erhvervede evnen til at spalte protein-DNA-bindinger og formidle nye funktioner (f.eks. transkriptionel regulering og signaltransduktion) via protein-protein-interaktioner uden at forstyrre den gamle RNA-specifikke phosphodiesterase-aktivitet.


Resultater

Sekvensanalyse, ekspressionsmønster og subcellulær lokalisering af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN

Vi startede denne undersøgelse ved kloning og sekventering af fire nøgler 5'RDG'er fra N. benthamiana, herunder NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN. Sekvensanalyse afslørede, at de åbne læserammer (ORF'er) af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN indeholde henholdsvis 1113 nt (GenBank-adgangsnummer: KY402210), 966 nt (GenBank-adgangsnummer: KY402211), 2949 nt (GenBank-adgangsnummer: KY402212) og 2056 nt (GenBank-adgangsnummer: KY4022). De udledte aminosyresekvenser af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN deler 70,2 %, 68,4 %, 67,1 % og 62 % identitet med deres modstykker AtDCP1, AtDCP2, AtXRN4 og AtPARN fra Arabidopsis. At dokumentere grundlæggende biologiske træk ved disse 5'RDG'er fra N. benthamiana, bestemte vi ekspressionsmønsteret af disse gener og subcellulær lokalisering af deres kodede proteiner. Kvantitativ real-time revers-transkription PCR (qRT-PCR) blev udført under anvendelse af totalt RNA isoleret fra forskellige N. benthamiana væv som skabelon. Alle de fire gener blev konstitutivt udtrykt, men deres ekspressionsniveauer varierede i forskellige væv (Fig. 1A). Samlet set viste alle de fire gener det højeste ekspressionsniveau i rodvævet og det laveste i stamvævet.

(EN) qRT-PCR analyse af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN ekspressionsniveauer i forskellige væv af N. benthamiana. Udtrykket blev normaliseret imod NbActin transskriptioner, der fungerer som en intern standard. Hver middelværdi blev afledt af tre uafhængige eksperimenter (n = 3 prøver). Værdier repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse (SD). (B) Mikrofotografier, der viser celler fra blade af H2B-RFP transgene N. benthamiana udtrykker YFP-NbDCP1, YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 eller YFP-NbPARN. Stænger = 50 μm. (CWestern Blot (WB) analyse af totale proteinekstrakter fra infiltrerede blade som angivet i (B) 32 timer efter infiltration (hpi), blev antistof mod GFP (WB:GFP) påført. Røde asterisker angiver de forventede båndstørrelser. Coomassie brilliant blåfarvet Rubisco stor underenhed blev brugt som en ladningskontrol.

At undersøge den subcellulære lokalisering af disse fire N. benthamiana 5'RDG'er, deres kodende regioner blev først introduceret i pDNOR221-vektor ved BP-reaktion (Invitrogen), efterfulgt af rekombination i ramme nedstrøms for den kodende sekvens af gult fluorescensprotein (YFP) ved LR-reaktion (Invitrogen). De kimære gener blev forbigående udtrykt i blade af transgent H2B-RFP N. benthamiana planter, og fluorescens blev undersøgt i agroinfiltrerede transgene blade 32 timer efter infiltration (hpi) ved konfokal mikroskopi (Fig. 1B). YFP-NbDCP1 var overvejende til stede i cytoplasmaet og dannede de runde granula, hvorimod de tre andre inklusive YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 og YFP-NbPARN var tydelige i både cytoplasma og kerne, og nogle af YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 og YFP-NbPARN aggregeret til også at danne granulat i cytoplasmaet (Fig. 1B). Western blotting ved hjælp af GFP (WB:GFP) antistof (Fig. 1C) detekterede det forventede og specifikke bånd svarende til det YFP-mærkede NbDCP1-, NbDCP2-, NbXRN4- og NbPARN-protein, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​rekombinante proteiner i fuld længde.

Interaktionen og co-lokaliseringen af ​​NbDCP1, NbDCP2 og NbXRN4

For at bestemme, om NbDCP1, NbDCP2 og NbXRN4 interagerer med hinanden, udførte vi bimolekylære fluorescenskomplementeringsassays (BiFC) [25]. De N- og C-YFP-mærkede proteiner blev co-udtrykt i blade af transgen H2B-RFP N. benthamiana planter og analyseret ved levende celle fluorescensmikroskopi ved 32 hpi (Fig. 2A). Selv såvel som alle gensidige kombinationer af NbDCP1, NbDCP2 og XRN4 viste positive interaktioner. P3N-PIPO, som er et dedikeret bevægelsesprotein af TuMV [26], blev fusioneret til N- eller C-YFP for at tjene en negativ kontrol (Fig. 2A). De virale proteiner P3N-PIPO og CI, der interagerer for at danne et kompleks for viral celle-til-celle bevægelse [27] blev brugt som en positiv kontrol (S1 Fig). Interessant nok var det selvinteragerende NbDCP2-kompleks til stede i cytoplasmaet også i kernen. Bortset fra det selvinteragerende NbDCP2-kompleks og kombinationen NbDCP2-N-YFP og NbXRN4-C-YFP, som begge var jævnt fordelt i cytoplasmaet, dannede de resterende kombinationer alle cytoplasmatiske foci, uanset gensidig fusion med en N- eller C -YFP (Fig. 2A).

(EN) BiFC-assays mellem NbDCP1, NbDCP2 og NbXRN4 i H2B-RFP transgene N. benthamiana afgår ved 32 hpi. Gul fluorescens (grøn) var resultatet af interaktionen af ​​to testede proteiner mærket af den C-terminale halvdel af YFP (C-YFP) eller den N-terminale halvdel af YFP (N-YFP). Kerner i tobaksbladepidermale celler er angivet ved ekspression af H2B-RFP-transgenet (rødt). P3N-PIPO mærket af C-YFP eller N-YFP fungerer som en negativ kontrol. Stænger = 50 μm. (B) Co-lokalisering af NbDCP1, NbDCP2 og NbXRN4 i H2B-RFP transgene N. benthamiana bladceller ved 32 hpi. De gule signaler stammer fra overlapningen af ​​NbDCP1-CFP (grøn) med YFP-NbDCP2 (rød) eller YFP-NbXRN4 (rød) eller NbDCP2-CFP (grøn) med YFP-NbXRN4 (rød). Indsæt er de forstørrede billeder af områderne i hvide felter i de tilsvarende paneler. H2B-RFP er vist i blåt. Stænger = 50 μm.

Vi udførte yderligere et co-lokaliseringsassay for at bekræfte, om disse interaktionskomplekser dannes i de samme proteinkomplekser. C-terminalt cyan fluorescerende protein (CFP) fusioneret NbDCP1 (NbDCP1-CFP) og N-terminal YFP fusioneret NbDCP2 (YFP-NbDCP2) eller NbXRN4 (YFP-NbXRN4) eller C-terminal CFP fusioneret NbDCP2 (NbDCP2-CFP) -NbXRN4 blev co-udtrykt i bladene af H2B transgene N. benthamiana planter, og konfokal mikroskopi blev udført ved 32 hpi. Vi fandt ud af, at NbDCP1-CFP og YFP-NbDCP2 eller YFP-NbXRN4 co-lokaliserede i cytoplasmaet for at danne de lyse granula (Fig. 2B). Sådanne lyse foci blev også observeret i cytoplasmaet af celler, der co-udtrykker NbDCP2-CFP og YFP-NbXRN4 (Fig. 2B). Tilsammen tyder disse data på, at NbDCP1, NbDCP2 og NbXRN4 kan danne proteinkomplekser gennem protein-protein-interaktioner.

Overekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN undertrykker ikke GFP-induceret RNA-dæmpning

Adskillige nyere undersøgelser har rapporteret, at essentielle komponenter i den cytoplasmatiske 5'–3' RNA-henfaldsvej, herunder XRN4 og DCP2, kan undertrykke sense RNA-induceret PTGS (S-PTGS), men ikke inverteret gentagen RNA-induceret PTGS (IR-PTGS) i Arabidopsis, hvilket tyder på, at RNA-silencing- og 5'-3' RNA-henfaldsvejene er indbyrdes forbundet, muligvis ved at dele det samme RNA-substrat [28,29]. Konsekvent øger kompromitterende nonsens-medieret henfald, deadenylering eller exosomaktivitet S-PTGS, som kræver værts-RNA-afhængig RNA-polymerase 6 (RDR6) og SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3 (SGS3) for transformationen af ​​enkeltstrenget RNA til dsRNA for at udløse PTGS [30,31]. For at afgøre, om N. benthamiana 5'RDG'er påvirker også S-PTGS og IR-PTGS som dem i Arabidopsis, Agrobacterium kulturer, der udtrykker 35S-GFP, 35S-GF (GF: et fragment af GFP, der kan inducere S-PTGS, Fig. 3A) og N-Myc-mærket NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN blev co-infiltreret i N. benthamiana blade. Blade co-infiltreret med 35S-GFP, 35S-GF og tom vektor (Vec) eller vektoren til ekspression af TBSV P19 (en velkendt gendæmpningssuppressor) tjener kontroller. Agroinfiltration af N. benthamiana blade med 35S-GFP, 35S-GF og Vec-induceret GFP RNA-dæmpning og førte til reduceret GFP-fluorescens under UV-lys 5 dage efter infiltration (dpi) (Fig. 3B). Mens intensiteten af ​​grøn fluorescens steg væsentligt i bladpletter, der co-udtrykker GFP og P19, blev der ikke observeret nogen tydelige forskelle i fluorescens blandt bladpletter, der co-udtrykte Myc-mærket NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN eller co-infiltrerede med vektorkontrollen (Fig. 3B). Derfor var forbigående ekspression af de fire 5'RDG'er ikke i stand til at undertrykke den sense RNA-trigger (35S-GF)-induceret GFP tavshed. Tværtimod førte ekspression af disse 5'RDG'er til generering af flere GFP-afledte siRNA'er og de reducerede niveauer af GFP mRNA og protein, der forbedrer sense GFP-induceret RNA-dæmpning (Fig 3D og 3F). Vi undersøgte også de mulige virkninger af de fire 5'RDG'er på dsRNA-induceret gendæmpning. I lighed med tidligere observationer [28-30] var der ingen åbenlys RNA-dæmpningsundertrykkelse eller -forstærkning, når 35S-dsGF (dsRNA af GF) som lyddæmpningsudløser co-udtrykte med 35S-GFP og N-Myc-mærket NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN in N. benthamiana blade (Fig. 3C, 3E og 3G). Som en positiv kontrol undertrykte P19 S-PTGS og IR-PTGS og intensiverede GFP-fluorescens, hvilket blev bekræftet ved immunoblot- og RNA-blot-analyser (Fig 3). Tilsammen viser disse data, at de fire N. benthamiana 5'RDG'er er sandsynligvis involveret i GFP-induceret S-PTGS, men ikke i IR-PTGS.

(EN) Skematisk repræsentation af RNA-fragmentet afledt af ekspressionsvektorerne GFP, GF og dsGF. (B, C) Billeder af repræsentative agroinfiltrerede blade taget ved 5 dpi under UV-lys. Bladpletter blev agroinfiltreret med tre vektorer inklusive 35S-GFP, 35S-GF (eller 35S-dsGF) og en af ​​følgende vektorer: en tom vektor (Vec), Myc-tagged-NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN og TBSV p19 (B). Lignende resultater blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter. (D, E) Analyser af relative ophobninger af GFP mRNA'er ved specifik qRT-PCR i de infiltrerede blade vist i (B, C) ved 5 dpi. NbActin fungerer som en intern standard. Hver middelværdi blev beregnet baseret på tre uafhængige eksperimenter (n = 3 prøver). Værdier repræsenterer middelværdien ± SD. Dobbelte stjerner angiver en meget signifikant forskel sammenlignet med 35S-GFP+35S-GF+Vec (D) eller 35S-GFP+35S-dsGF+Vec (E) (P < 0,01, studerendes t prøve). (F, G) Akkumuleringer af GFP-protein, Myc-mærket-NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN-protein, GFP mRNA'er og siRNA'er i de infiltrerede blade vist i (B, C) ved 5 dpi. Proteinniveauer blev analyseret ved immunblot-analyse under anvendelse af antistoffer mod GFP (WB:GFP) eller Myc (WB:Myc). Coomassie brilliant blue (CBB)-farvning af den store underenhed af Rubisco, ethidiumbromid-farvning af rRNA og U6 tjener som belastningskontrol for henholdsvis immunoblot, mRNA blot og siRNA blot. Værdierne af GFP siRNA'er/U6 blev kvantificeret af ImageJ-software og derefter normaliseret mod middelværdien svarende til Vec-behandlingen, som blev sat til 1,00.

Nedbrydning af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN hæmmer S-PTGS, ikke IR-PTGS

For yderligere at bestemme, om NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN er involveret i RNA-silencing, tre ekspressionsvektorer, herunder 35S-GFP, 35S-GF og en hårnåle RNAi-konstruktion, der indeholder NbDCP1 (dsNbDCP1), NbDCP2 (dsNbDCP44) , NbNXRN eller NbNXRN. (dsNbPARN) sekvenser under kontrol af blomkålsmosaikvirus (CaMV) 35S promotor, blev agroinfiltreret i blade af N. benthamiana planter. Sammenlignet med den svage GFP-fluorescens i N. benthamiana bladpletter infiltreret med 35S-GFP, 35S-GF og Vec, ekspression af dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 eller dsNbPARN førte til en stigning i grøn fluorescens i co-infiltrerede områder (Fig. 4A), hvilket indikerer, at dæmpning af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN undertrykt sense GFP-induceret RNA-dæmpning. I overensstemmelse hermed afslørede qRT-PCR-, RNA-blot- og proteingel-blot-analyser, at undertrykkelse af GFP-dæmpning af dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 eller dsNbPARN blev ledsaget af de øgede niveauer af GFP mRNA og protein, og de reducerede niveauer af GFP-specifikke siRNA'er i de infiltrerede blade (Fig. 4B og 4C). Som en kontrol kunne en hårnåle-RNAi-konstruktion af GUS ikke undertrykke S-PTGS (S2B Fig), hvilket indikerer, at knock-down af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN hæmmer specielt S-PTGS, og ekspression af ikke-relateret dsRNA overbelaster og hæmmer ikke lyddæmpningsmaskineriet. Når 35S-GFP og 35S-dsGF blev co-udtrykt med dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 eller dsNbPARN i N. benthamiana, der blev ikke påvist GFP-fluorescens i de co-infiltrerede områder, svarende til de Vec-infiltrerede bladpletter (Fig. 4D). I modsætning hertil blev stærke GFP-signaler påvist i P19 co-udtrykkende plastre. GFP-specifikke siRNA blots viste, at i sammenligning med Vec, lyddæmpning af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN undertrykte drastisk produktionen af ​​sekundære siRNA'er ('P' siRNA'er) under S-PTGS, men viste ingen åbenlyse ændringer i akkumuleringen af ​​primære siRNA'er ('GF' siRNA'er) under IR-PTGS (Fig. 4E og 4F). Disse data understøtter, at NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN deltager i GFP-induceret S-PTGS, men ikke er involveret i IR-PTGS.

(A, D) Visualisering af grøn fluorescens af repræsentative agroinfiltrerede blade. Bladpletter blev agroinfiltreret med tre ekspressionsvektorer inklusive 35S-GFP, 35S-GF (eller 35S-dsGF) og en af ​​følgende vektorer: en tom vektor (Vec), dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4, dsNbPARN, P19, Myc-mærket- NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN. Billeder blev taget ved 5 dpi under UV-lys. Lignende resultater blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter. (B, E) Relativ akkumulering af GFP mRNA'er i agroinfiltrerede pletter af de infiltrerede blade angivet i henholdsvis (A) og (D). Totalt RNA blev isoleret ved 5 dpi og GFP mRNA blev analyseret ved qRT-PCR. NbActin fungerer som en intern standard. Hver middelværdi blev afledt af tre uafhængige eksperimenter (n = 3 prøver). Værdier repræsenterer middelværdien ± SD. Dobbelte stjerner angiver en meget signifikant forskel sammenlignet med 35S-GFP+35S-GF+Vec (B) eller 35S-GFP+35S-dsGF+Vec (E) (P < 0,01, studerendes t prøve). (C, F) Akkumulering af GFP-protein, GFP mRNA og siRNA'er i de infiltrerede blade vist i henholdsvis (A) og (D). Prøver blev opsamlet ved 5 dpi. CBB-farvning af den store underenhed af Rubisco, ethidiumbromid-farvning af rRNA og U6 tjener som belastningskontrol for henholdsvis immunoblot, mRNA blot og siRNA blot. Værdierne af GFP siRNA'er/U6 blev kvantificeret af ImageJ-software og blev derefter normaliseret mod middelværdien svarende til Vec-behandlingen, som blev sat til 1,00.

NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN nedbrydes GFP RNA via RNA-henfaldsvejen i RDR6-deficiente planter

For at analysere rollen af ​​NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN i RNA-henfald i fravær af S-PTGS brugte vi dsRDR6 transgene planter, i hvilken forstand GFP induceret S-PTGS er kompromitteret [32]. Tre ekspressionsvektorer inklusive 35S-GFP, 35S-GF og en af ​​følgende vektorer: NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN og en tom vektor (Vec) blev co-infiltreret i dsRDR6 transgenic N. benthamiana blade. Ved 5 dpi viste bladplastret infiltreret med 35S-GFP, 35S-GF og Vec stadig den stærke GFP-fluorescens på grund af undertrykkelsen af ​​S-PTGS i dsRDR6 N. benthamiana blade sammenlignet med den tilsvarende patch i vildtype (Wt) N. benthamiana blade (Fig. 5A). Ekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN i dsRDR6 transgene planter reducerede GFP-fluorescens i sammenligning med Vec-kontrollen (Fig. 5A). qRT-PCR, RNA og protein gel blot-analyser afslørede, at den reducerede fluorescens i bladpletter, der udtrykker NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN, blev ledsaget af en reduktion af begge GFP mRNA og protein, men uden en stigning af GFP-specifikke siRNA'er (Fig. 5B og 5C). Disse data tyder på, at i RDR6-mangelfulde planter undertrykker NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN GFP ekspression gennem RNA-henfaldsvejen. Derudover blev 35S-GFP og 35S-GF også co-infiltreret med dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 eller dsNbPARN i dsRDR6 bladpletter. I overensstemmelse med vores data i Fig 4, meget stærkere fluorescens og flere GFP RNA-akkumuleringer blev observeret, når dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 eller dsNbPARN blev co-udtrykt med 35S-GFP og 35S-dsGF sammenlignet med Vec ved 7 dpi (S3 Fig). Tilsammen tyder disse data på, at alle fire 5'RDG'er fremmer RNA-silencing til mål GFP RNA i Wt N. benthamiana planter og nedbrydes GFP transkripter gennem RNA-henfald i de RDR6-deficiente planter, hvor S-PTGS er blokeret. Således har RNA-dæmpning i forhold til RNA-henfald den prioritet at nedbrydes GFP RNA.

(EN) Visualisering af grøn fluorescens af repræsentative agroinfiltrerede blade. Billeder af repræsentative agroinfiltrerede blade blev taget ved 5 dpi under UV-lys. Vildtype (Wt) N. benthamiana eller dsRDR6 transgen N. benthamiana (dsRDR6) planter blev agroinfiltreret med tre ekspressionsvektorer inklusive 35S-GFP, 35S-GF og en af ​​følgende vektorer: en tom vektor (Vec) som kontrol, Myc-mærket-NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN. Lignende resultater blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter. (B) Akkumulering af GFP-protein, GFP mRNA og siRNA'er i de infiltrerede blade vist i (A) ved 5 dpi. CBB-farvning af den store underenhed af Rubisco, ethidiumbromid-farvning af rRNA og U6 tjener som belastningskontrol for henholdsvis immunoblot, mRNA blot og siRNA blot. (C) Relativ akkumulering af GFP mRNA'er analyseret ved specifik qRT-PCR i de infiltrerede blade vist i (A) ved 5 dpi. NbActin fungerer som en intern standard. Hver middelværdi blev beregnet baseret på tre uafhængige eksperimenter (n = 3 prøver). Værdier repræsenterer middelværdien ± SD. Dobbelte stjerner indikerer en meget signifikant forskel sammenlignet med 35S-GFP+35S-GF+Vec/dsRDR6 (P < 0,01, studerendes t prøve). Værdierne af GFP siRNA'er/U6 blev kvantificeret af ImageJ-software og blev derefter normaliseret mod middelværdien svarende til Vec-behandlingen i Wt N. benthamiana planter, som blev sat til 1.00.

Viral infektion opregulerer RNA-henfaldsvejen

For at tydeliggøre rollen af ​​RNA-henfald i TuMV-infektion bestemte vi ekspressionsniveauerne for de fire 5'RDG'er i TuMV-inficerede lokale og systemiske blade af N. benthamiana planter ved 3 og 10 dpi ved at bruge qRT-PCR (fig. 6A og 6B). Udtryksniveauerne for alle de fire 5'RDG'er var signifikant opreguleret i både lokale og systemiske blade som reaktion på TuMV-infektion (Fig. 6A og 6B). Vi kontrollerede yderligere, om TuMV-replikationsproteiner eller replikationsvesikler er forbundet med P-legemer. Det afkappende protein DCP1 er en veletableret markør for P-legemer i planter [11,33]. Vi co-udtrykte NbDCP1-CFP og tre TuMV-kodede replikationskrævede proteiner inklusive 6K2 (som inducerer dannelsen af ​​virale replikationsvesikler til virusreplikation), 6K2-NIa-VPg (indeholdende det genom-koblede virale protein VPg) og NIb ( den eneste virale RNA-afhængige RNA-polymerase) med YFP mærket til deres respektive C-terminale ende. Ingen typiske co-lokaliseringssignaler blev observeret mellem NbDCP1 og disse virale proteiner (Fig. 6C). Mulig co-lokalisering mellem 5'RDG'er og virale replikationsproteiner blev også testet ved hjælp af to TuMV infektiøse kloner TuMV-6K2-mCherry og TuMV-CFP-NIb [34,35]. Førstnævnte indeholder en ekstra kopi af mCherry-mærket 6K2, og i sidstnævnte er NIb mærket af en N-terminal CFP. Der blev ikke fundet nogen co-lokalisering mellem NbDCP1 og de 6K2-mærkede virale replikationsvesikler eller CFP-mærket NIb (Fig. 6D). Disse tyder på, at TuMV-infektion opregulerer RNA-henfaldsvejen, som tilsyneladende ikke er forbundet med virusreplikationskomplekset.

(A, B) Udtryksniveauerne for NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 og NbPARN blev analyseret ved qRT-PCR i mock (infiltrationsbuffer) eller TuMV-infiltreret N. benthamiana blade ved 3 dpi (A) eller øverste nye blade ved 10 dpi (B). NbActin blev brugt som intern standard. Hver middelværdi blev beregnet baseret på tre uafhængige biologiske gentagelser (n = 3 prøver). Værdier repræsenterer middelværdien ± SD. Dobbelte stjerner angiver en meget signifikant forskel sammenlignet med mock ved 3 dpi (A) eller 10 dpi (B) (P < 0,01, studerendes t prøve). (C) Konfokal mikroskopianalyse af celler, der co-udtrykker NbDCP1-CFP (grøn) og 6K2-YFP (panel I, rød) eller 6K2-NIa-VPg-YFP (panel II, rød) eller NIb-YFP (rude III, rød) ) ved 32 hpi. Stænger, 25 μm. (D) Konfokal mikroskopi af celler, der co-udtrykker NbDCP1-YFP (grøn) og TuMV-6K2-mCherry (panel I og panel II, rød) eller TuMV-CFP-NIb (panel III, rød) ved 72 hpi. Det forstørrede billede af området i den hvide boks i panel I er vist i panel II. Stænger = 50 μm.

Co-ekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN hæmmer TuMV RNA-akkumulering

For at undersøge om disse N. benthamiana 5'RDG'er påvirker TuMV RNA-akkumulering, TuMV-GFP blev co-infiltreret ind i N. benthamiana forlader med NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN eller en tom vektor (Vec). Ved 3 dpi infiltrerede bladpletterne med disse N. benthamiana 5'RDG'er viste svagere GFP-fluorescens sammenlignet med Vec-kontrollen (Fig. 7A). Da GFP stammede fra det rekombinante virus, kunne dets fluorescerende intensitet anses for at være en indikator for TuMV-replikation. qRT-PCR-analyser bekræftede de reducerede virale RNA-niveauer i bladpletter, der co-udtrykker NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN (Fig. 7C). Konsekvent blev denne reduktion ledsaget af en stigning i TuMV-siRNA'er (Fig. 7F). Vi kontrollerede også, om NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN påvirker TuMV-infektion i dsRDR6-transgene N. benthamiana planter (Fig. 7B).Overekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN i dsRDR6 transgene planter hæmmede også TuMV-infektion, hvilket fremgår af svækket GFP-fluorescens og reducerede niveauer af virale RNA'er (Fig. 7B og 7C). Interessant nok blev bemærkelsesværdige mængder af TuMV-afledte siRNA'er påvist i den Vec-infiltrerede kontrolprøve af dsRDR6 transgene planter, muligvis på grund af primær silencing induceret af viralt dsRNA (viralt RNA replikative mellemprodukter) under robust viral replikation (Fig. 7F). Disse data viser, at ekspression af 5'RDG'er hæmmer TuMV RNA-akkumulering i både Wt- og dsRDR6-transgene planter.

(A, B) GFP-fluorescens i Wt eller RDR6-deficient (dsRDR6) N. benthamiana blade co-infiltreret med TuMV-GFP og en af ​​følgende vektorer: Vec, NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN ved 3 dpi. (C) qRT-PCR analyser af TuMV RNA niveauer. RNA blev ekstraheret fra de infiltrerede plastre vist i (A) ved 3 dpi. Hver værdi blev normaliseret imod NbActin transskriptioner i samme prøve. Fejlbjælker repræsenterer SD (n = 3 uafhængige biologiske gentagelser). Dobbelte stjerner indikerer en meget signifikant forskel sammenlignet med behandlingen af ​​Vec (P < 0,01, studerendes t prøve). (D, E) GFP-fluorescens i Wt eller RDR6-deficient (dsRDR6) N. benthamiana blade co-infiltreret med TuMV-GFP-ΔGDD (en replikationsdefekt mutant) og en af ​​følgende vektorer: Vec, NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN ved 3 dpi. (F) Akkumulering af TuMV siRNA'er i de infiltrerede plastre vist i (A, B, D, E) ved 3 dpi. Northern blotting blev udført under anvendelse af DIG-mærkede DNA-prober komplementære til TuMV-genomet. U6 tjener som en belastningskontrol for henholdsvis siRNA blot. Værdierne af GFP siRNA'er/U6 blev kvantificeret af ImageJ-software og blev derefter normaliseret mod middelværdien svarende til Vec-behandlingen, som blev sat til 1,00.

At undersøge 5'RDGs-medieret antiviralt forsvar uden dsRNA-medieret primær silencing i Wt og dsRDR6 transgenic N. benthamiana, brugte vi en replikationsdeficient TuMV infektiøs klon, TuMV-GFP-AGDD [36]. Denne klon tillader transkription af virale RNA'er i fuld længde i plantecellen og efterfølgende translation af virale proteiner. Da det meget konserverede GDD-motiv i NIb er muteret, mister klonen evnen til at biosyntetisere RNA og til at generere virale RNA-replikative mellemprodukter. I sammenligning med Vec-kontrollen, ekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN i Wt N. benthamiana undertrykte TuMV-GFP-ΔGDD RNA-akkumulering og øgede bemærkelsesværdigt niveauet af TuMV-siRNA'er (Fig. 7F). I dsRDR6 transgene planter reducerede overekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN akkumuleringen af ​​TuMV-GFP-ΔGDD transkripter og undertrykte dannelsen af ​​TuMV-GFP-ΔGDD transkripter-afledte siRNA'er (Fig. 7F). Disse data tyder på, at NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN kan nedbryde TuMV RNA via RNA-henfaldsvejen, når PTGS er afbrudt.

For at minimere interferensen af ​​input-RNA udførte vi også denne analyse med en meget lav koncentration af agrobakterielle kulturer (OD600 = 0,05), der huser TuMV eller TuMV-ΔGDD. Som forventet var viral RNA-akkumulering i TuMV-infiltrerede Wt- eller dsRDR6-transgene planter signifikant højere end i bladene infiltreret med TuMV-ΔGDD (S4A Fig). Overekspression af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN sammenlignet med Vec reducerede TuMV- eller TuMV-ΔGDD-RNA-akkumuleringer. Overekspression af disse RNA-henfaldskomponenter resulterede også i et tydeligt fald i TuMV-afledte siRNA'er (S4B, Fig. 7F). På grund af infiltration med en meget lavere koncentration af agrobakteriel kultur blev der ikke fundet detektive virale siRNA'er i TuMV-ΔGDD-infiltrerede blade. Disse resultater tyder endvidere på, at under viral replikation stammer siRNA'er hovedsageligt fra virale RNA-replikative mellemprodukter, som er proportionale med virale RNA-akkumuleringer, snarere end fra RDR6-afhængige sekundære siRNA'er. Tilsammen understøtter disse data, at 5'RDG'er fungerer som planteforsvar mod TuMV RNA-akkumulering.

Nedbrydning af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN forstærker virale lokale og systemiske infektioner

For yderligere at undersøge effekten af ​​lyddæmpning af 5'RDG'er på TuMV-infektion, N. benthamiana bladpletter blev agroinfiltreret med TuMV-GFP og en af ​​følgende vektorer: en tom vektor (Vec) som kontrol, NbDCP1, dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 og dsNbPARN. Ved 4 dpi, knock-down af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN førte til de øgede niveauer af TuMV-GFP fluorescens, GFP-proteiner og TuMV RNA, og et reduceret niveau af TuMV siRNA'er (Fig. 8A og 8B og S5 Fig). Således tavshed af NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN fremmede TuMV RNA-akkumuleringer muligvis gennem undertrykkelse af TuMV-afledt siRNA-produktion. For at verificere, om dette også gælder for TuMV systemisk infektion, en modificeret TRV VIGS vektor, der bærer den delvise sekvens af GUS (som en kontrol), NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN blev præ-inokuleret i N. benthamiana at slå ned NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN udtryk (S6 Fig). Afdæmpede planter blev derefter inokuleret med TuMV-GFP. Ved 6 dpi begyndte GFP-signaler at dukke op langs årerne i nyudviklede blade under UV-lampe i TRV-GUS-behandlede planter (Fig. 8C). Dog alle NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 eller NbPARN-stillede planter udviklede meget stærkere GFP-signaler i de tilsvarende blade (Fig. 8C). Konsekvent blev der fundet højere niveauer af virale RNA'er og GFP-proteiner i 5'RDG'er- tavse planter (Fig. 8D og 8E). Det blev også bevist, at tavshed af 5'RDG'er hæmmede TuMV-afledte siRNA'er (Fig. 8E). Disse data tyder på, at knock-down af 5'RDG'er letter TuMV-infektion og undertrykker virale siRNA'er i N. benthamiana.

(EN) GFP fluorescens i N. benthamiana blade co-infiltreret med TuMV-GFP og en af ​​følgende ekspressionsvektorer: en tom vektor (Vec) som kontrol, NbDCP1, dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 og dsNbPARN ved 4 dpi. (B) Relative TuMV RNA-niveauer bestemt ved qRT-PCR. RNA blev ekstraheret fra de infiltrerede plastre vist i (A) ved 4 dpi. Hver værdi blev normaliseret imod NbActin transskriptioner i samme prøve. Fejlbjælker repræsenterer SD (n = 3 uafhængige biologiske gentagelser). *, P < 0,05 **, P < 0,01 (Students t prøve). (C) GFP-fluorescens i systemiske blade af planter forbehandlet med TRV-GUS, TRV-NbDCP1, TRV-NbDCP2, TRV-NbXRN4 eller TRV-NbPARN og derefter inficeret med TuMV-GFP blev fotograferet under UV-lys ved 6 dpi. (D) Relative TuMV RNA-niveauer bestemt ved qRT-PCR. RNA blev ekstraheret fra planter i (C) ved 14 dpi. *, P < 0,05 **, P < 0,01 (Students t prøve). (E) Akkumulering af GFP-protein og TuMV siRNA'er i de systemiske blade af planter i (C) ved 14 dpi. CBB-farvning af den store underenhed af Rubisco og U6 tjener som en ladningskontrol for henholdsvis immunoblot, mRNA blot og siRNA blot. Værdierne af GFP siRNA'er/U6 blev kvantificeret af ImageJ-software og blev derefter normaliseret mod middelværdien svarende til TRV-GUS-behandlingen, som blev sat til 1,00.

For yderligere at undersøge, om disse 5'RDG'er også hæmmer TuMV-infektion i Arabidopsis, opnåede vi Arabidopsis knockdown-mutanter af DCP2 og PARN, og knockout-mutanter af DCP1 og XRN4 (S7 Fig). I sammenligning med Wt Arabidopsis-planter viste alle mutanter øget modtagelighed for TuMV-infektion ved akkumulering af højere niveauer af viralt RNA (S8 Fig). Det er klart, at 5'RDG'er spiller en anti-TuMV-rolle i begge N. benthamiana og Arabidopsis-arter.

VPg interagerer med og målretter DCP2 til kernen for at hæmme dannelsen af ​​de cytoplasmatiske DCP1/DCP2-granulat

For at screene for mulige protein-protein-interaktioner mellem de fire 5'RDG'er og 11 TuMV-proteiner, udførte vi gær to-hybrid (Y2H) assays. Alle de testede proteiner blev fusioneret med GAL4-transkriptionsaktiveringsdomænet (AD) og GAL4 DNA-bindingsdomænet (BD). Som opsummeret i Fig. 9A og 9B, uanset om AD- eller BD-fusioner blev brugt til assayet, blev der kun fundet positive interaktioner mellem NbDCP2 og VPg og mellem NbXRN4 og HC-Pro.

(A, B) Sammenfatning af Y2H-analyseresultater. Y2H Gold gærstammer co-transformeret med de angivne plasmider blev udpladet på syntetisk dextrose (SD)/-Trp, -Leu, -His, -Ade medium for at identificere proteininteraktioner 3 dage efter transformation. Proteiner blev fusioneret til enten Gal4 DNA-bindings- (BD) eller aktiverings- (AD) domæne. Nej betyder ingen positiv interaktion mellem to testede proteiner, Ja betyder positiv interaktion mellem to testede proteiner, og '-' betyder, at NbDCP1 har selvaktiverende aktivitet, når den fusioneres til BD-vektor, hvilket indikerer en uautentisk interaktion. (C, D) Y2H-assays for NbDCP2 og VPg (C) og NbXRN4 og HC-Pro (D). Y2H Gold-gærstammer co-transformeret med de angivne plasmider blev udsat for 10-fold seriefortyndinger og udpladet på SD/-Trp, -Leu, -His, -Ade medium for at identificere proteininteraktioner 3 dage efter transformation. Celler co-transformeret med AD-T7-T+BD-T7-53 tjener som positive kontrolceller co-transformeret med AD-NbDCP2 eller AD-NbXRN4 og den tomme BD, eller den tomme AD og BD-NbDCP2 eller BD-NbXRN4 er negative kontroller.

Interaktionen mellem NbDCP2 og VPg blev yderligere bekræftet af BiFC i transgen N. benthamiana udtrykker H2B-RFP som en nuklear markør (Fig. 10A). NbDCP2 og VPg interaktionen blev påvist i kernen (Fig. 10A og S10 Fig). Konsekvent interagerede NbDCP2 med NbDCP1 (tjener som en positiv kontrol) og dannede lyse granuler i cytoplasmaet, og der blev ikke fundet interaktion mellem NbDCP1 og VPg (Fig. 10A). Det faktum, at NbDCP2 interagerer med VPg i kernen og med NbDCP1 i cytoplasmaet for at danne det decapping kompleks, der kræves for 5'–3' RNA henfald [11,33] fik os til at undersøge, om TuMV VPg negativt regulerer samlingen af NbDCP1/NbDCP2-afdækningskomplekset. For at teste denne hypotese blev YN-NbDCP1 og YC-NbDCP2 eller YN-NbDCP2 og YC-NbDCP1 co-infiltreret med VPg i H2B-RFP-bladene. Ingen interaktionssignaler mellem NbDCP1 og NbDCP2 blev detekteret, når VPg blev co-udtrykt (Fig. 10A), hvilket tyder på, at VPg faktisk forstyrrer NbDCP1- og NbDCP2-interaktionen.

(EN) BiFC-assays for mulige protein-protein-interaktioner i planta. NbDCP1, NbDCP2 og VPg blev fusioneret med YN eller YC. De fusionerede proteiner blev forbigående udtrykt i H2B-RFP transgene N. benthamiana blade. Konfokal mikroskopi blev udført ved 32 hpi. Gul fluorescens (grøn) blev observeret i bladcellerne, der co-udtrykker NbDCP1 + NbDCP2 eller NbDCP2 + VPg, men ikke i cellerne, der co-udtrykker NbDCP1 + VPg eller NbDCP1 + NbDCP2 i nærvær af VPg. Kerner i tobaksbladepidermale celler er angivet ved ekspression af H2B-RFP-transgenet (rødt). Stænger = 25 μm. (B) Co-lokalisering af VPg + NbDCP1, VPg + NbDCP2, NbDCP1 + NbDCP2 i nærværelse af en tom vektor (+Vec) eller VPg (+VPg) i vildtype N. benthamiana bladceller. Konfokal mikroskopi blev udført ved 32 hpi. Stænger = 25 μm. (C) Det gennemsnitlige antal NbDCP1/NbDCP2 co-lokaliseringsgranuler (pr. 10 celler), når de blev co-infiltreret med Vec (+Vec) eller VPg (+VPg). Uafhængige infiltrationseksperimenter blev gentaget tre gange, og 30 celler i alt blev brugt til at kvantificere. Værdier repræsenterer det gennemsnitlige antal af NbDCP1/NbDCP2-granulerne (pr. 10 celler) ± SD. Studerende t test blev udført for at sammenligne forskelle, og dobbelte stjerner indikerer en meget signifikant forskel (P < 0,01). (D) Immunoblotting-analyser af NbDCP2-CFP ved 2 dpi. Totale proteiner eller proteiner isoleret fra cytoplasmaet eller kernerne blev probet med GFP-antistoffer, og totale proteiner blev også inkuberet med Myc-antistoffer for at påvise Myc-VPg. Lige belastning for de nukleare og totale proteinprøver blev overvåget ved at sondere med henholdsvis Histon H2B-antistoffer og CBB-farvning.

Vi observerede yderligere den subcellulære co-lokalisering af VPg, NbDCP1 og NbDCP2. N. benthamiana blade blev co-infiltreret for at transient co-udtrykke VPg-YFP og NbDCP1-CFP eller NbDCP2-CFP. Der blev ikke observeret nogen co-lokalisering for VPg-YFP og NbDCP1-CFP, hvorimod VPg-YFP co-lokaliserede med NbDCP2-CFP i kernen (Fig. 10B, to øverste rækker). Desuden undertrykte co-ekspression af VPg bemærkelsesværdigt dannelsen af ​​NbDCP1/NbDCP2-granulerne i cytoplasmaet sammenlignet med vektorkontrollen (Fig. 10B, to nederste rækker, og 10°C). Indledningsvis spekulerede vi i, at den reducerede NbDCP1/NbDCP2-interaktion skyldtes det reducerede NbDCP2-proteinniveau induceret af VPg. For at teste denne mulighed blev totale proteiner ekstraheret fra bladene co-infiltreret med NbDCP2-CFP og tom vektor (Vec) eller Myc-VPg, og Western blot-analyse blev udført for at bestemme akkumuleringen af ​​NbDCP2-CFP. Co-ekspression af Myc-VPg påvirkede ikke åbenlyst NbDCP2-CFP-proteinniveauet (Fig. 10D). Efterfølgende overvejede vi muligheden for, at VPg-NbDCP2-interaktionen negativt kunne regulere fordelingen af ​​NbDCP2 i cytoplasmaet for at hæmme dannelsen af ​​NbDCP1/NbDCP2 cytoplasmatiske granula. For at teste denne antagelse ekstraherede vi de cytoplasmatiske og nukleare proteiner separat og udførte Western blot-analyse for at bestemme akkumuleringen af ​​NbDCP2-CFP i cytoplasmaet og nuklearen. Faktisk, da Myc-VPg blev co-udtrykt, faldt mængden af ​​NbDCP2-CFP naturligvis i cytoplasmaet, men steg bemærkelsesværdigt i kernen (Fig. 10D). Disse data tyder på, at TuMV VPg interfererer med interaktionen mellem NbDCP1 og NbDCP2 ved at målrette NbDCP2 fra cytoplasmaet til kernen.

HC-Pro interagerer med XRN4 og undertrykker XRN4-aktivitet

Interaktionen mellem HC-Pro og NbXRN4 blev verificeret ved BiFC-assays i N. benthamiana. Ekspressionsvektorer YN-HC-Pro, YC-HC-Pro, YN-NbXRN4 og YC-NbXRN4 blev genereret for at udtrykke HC-Pro- eller NbXRN4-fusioner med henholdsvis YN eller YC. Parvis ekspression af YN-HC-Pro og YC-NbXRN4 eller YN-NbXRN4 og YC-HC-Pro ved agroinfiltration resulterede i stærke YFP-fluorescenssignaler i cytoplasmaet ved 32 hpi (Fig. 11A). Ingen YFP-fluorescens kunne påvises i bladprøven, der co-udtrykker HC-Pro og NbDCP1, som fungerer som en negativ kontrol (Fig. 11A). Vi undersøgte også den subcellulære lokalisering af HC-Pro og NbXRN4 i N. benthamiana bladepidermale celler, der co-udtrykker CFP-mærket HC-Pro (HC-Pro-CFP) og YFP-mærket NbXRN4 (YFP-NbXRN4). Vi fandt ud af, at HC-Pro-CFP var lokaliseret i cytoplasmaet og kernen, og nogle dannede granulat i cytoplasmaet (Fig. 11B, panel I). HC-Pro-CFP co-lokaliseret med NbXRN4-CFP for at danne en lys prik i cytoplasmaet (Fig. 11B, panel III). Disse resultater bekræfter, at TuMV HC-Pro interagerer med NbXRN4.

(EN) BiFC-assays for at bekræfte HC-Pro- og NbXRN4-interaktionen i H2B-RFP N. benthamiana afgår ved 32 hpi. HC-Pro og NbXRN4 blev fusioneret med YN og YC. Gul fluorescens (grøn) blev observeret i cellerne, der co-udtrykker YN-HC-Pro+YC-NbXRN4 eller YC-HC-Pro+YN-NbXRN4. Co-ekspression af YN-HC-Pro+YC-NbDCP1 eller YC-HC-Pro+YN-NbDCP1 resulterede ikke i nogen påviselig fluorescens i H2B-RFP N. benthamiana forlader ved 32 hpi, hvilket afslørede, at HC-Pro ikke interagerede med NbDCP1. Stænger = 25 μm. (B) Samlokaliseringsanalyse af HC-Pro-CFP og YFP-NbXRN4 in N. benthamiana afgår ved 32 hpi. Panel I: HC-Pro-CFP blev udtrykt alene, Panel II: YFP-NbXRN4 blev udtrykt alene, Panel III: HC-Pro-CFP og YFP-NbXRN4 blev udtrykt sammen. Stænger = 25 μm. (C) Y2H-assays for AtXRN4 og HC-Pro. Y2H Gold-gærstammer co-transformeret med de angivne plasmider blev udsat for 10-fold seriefortyndinger og udpladet på SD/-Trp, -Leu, -His, -Ade medium for at identificere proteininteraktioner 3 dage efter transformation. Celler co-transformeret med AD-T7-T+BD-T7-53 tjener som positive kontroller celler co-transformeret med AD-HC-Pro og den tomme BD, eller den tomme AD og BD-AtXRN4 er negative kontroller. (D) BiFC-assays afslørede, at HC-Pro interagerede med AtXRN4 i H2B-RFP N. benthamiana afgår ved 32 hpi. P3N-PIPO og AtXRN4 fungerede som en negativ kontrol for protein-protein-interaktionsassayet. Stænger = 25μm. (E) Fænotyper af Col-0, xrn4 mutante og transgene Arabidopsis-planter transformeret med 35S:Myc-AtXRN4, 35S:HC-Pro-CFP-1, 35S:HC-Pro-CFP-2 og 35S:HC-Pro-CFP-1/35S:Myc-AtXRN4 kl. 20 dage efter såning. 35S:HC-Pro-CFP-1/35S:Myc-AtXRN4-planter blev opnået ved genetiske krydsninger mellem 35S:HC-Pro-CFP-1 og 35S:Myc-AtXRN4 Arabidopsis-planter. T2-generationsanlæg blev anvendt i ovenstående forsøg. Bekræftelsen af xrn4 mutante, transgene planter, der udtrykker 35S:Myc-AtXRN4, 35S:HC-Pro-CFP-1, 35S:HC-Pro-CFP-2 og 35S:HC-Pro-CFP-1/35S:Myc-AtXRN4, blev vist i S7 Fig og S10 Fig. (F, G, H) qRT-PCR analyse af På EBF1, AtRAP2.4, AtNMT udtryk i Col-0, xrn4 mutante og transgene planter, der bærer 35S:Myc-AtXRN4, 35S:HC-Pro-CFP-1 og 35S:HC-Pro-CFP-1/35S:Myc-AtXRN4 20 dage efter såning (F), i Col-0 og xrn4 mutante blade infiltreret af tom vektor (Vec) og HC-Pro ved 3 dpi (G), og i Col-0 nyligt opståede blade af mock- eller TuMV-inficerede planter 12 dpi (H). At ActinII gen blev brugt som en intern kontrol. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t test og stjerner angiver signifikante forskelle mellem behandlinger (* P <0,05, ** P <0,01).

For at vurdere den biologiske relevans af HC-Pro og XRN4 interaktionen brugte vi modelplanten Arabidopsis. Først bekræftede vi, at TuMV HC-Pro faktisk interagerer med AtXRN4, ortologen af ​​NbXRN4 i Arabidopsis ved at udføre Y2H-assays i gær (Fig. 11C) og BiFC-assays i N. benthamiana (Fig. 11D). Så fik vi en Arabidopsis xrn4 mutante og genererede transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker HC-Pro og AtXRN4. Interessant nok er fænotypen af xrn4 mutant efterlignede den milde fænotype af HC-Pro transgene Arabidopsis planter (Fig. 11E), som viste takkede bladkanter. Da P-legemet er RNA-henfaldsstedet, og HC-Pro interagerer med XRN4 i de cytoplasmatiske granula, der ligner P-legemet (Fig. 11A og 11D), spekulerede vi i, at ekspression af HC-Pro kunne undertrykke AtXRN4-funktionen i RNA-henfald. For at teste denne idé, tre potentielle substrater af AtXRN4 i RNA henfald, herunder På EBF1, AtRAP2.4 og AtNMT [37] blev analyseret. Vi fandt ud af, at mRNA-niveauerne af disse tre gener faktisk steg signifikant i xrn4 mutante Arabidopsis planter og faldt i XRN4 overekspression transgene planter (Fig. 11F). Overekspression af HC-Pro øgede signifikant mRNA-akkumuleringen af På EBF1, AtRAP2.4 og AtNMT, som blev antagoniseret af co-overekspression af AtXRN4 (Fig. 11F).Konsekvent afhjælpede co-overekspression af AtXRN4 delvist den typiske fænotype induceret af overekspression af HC-Pro (Fig. 11E) og udtryksniveauerne for På EBF1, AtRAP2.4 og AtNMT var ens i HC-Pro-udtrykkende Wt (Col-0) og xrn4 mutante planter (Fig. 11G). Desuden var niveauet af disse XRN4-substrater forhøjet i TuMV-inficerede planter (Fig. 11H), muligvis på grund af HC-Pro. Tilsammen tyder disse data på, at HC-Pro interagerer med XRN4, og interaktionen hæmmer XRN4-aktivitet.


Abstrakt

Uridylyleringen af ​​VPg-peptidprimeren er det første trin i replikationen af ​​picornavirus-RNA. Denne proces kan opnås in vitro ved at bruge oprensede komponenter, herunder 3B (VPg) med den RNA-afhængige RNA-polymerase (3D) pol ), precursoren 3CD og en RNA-skabelon indeholdende cre/bus. Vi viser, at visse RNA-sekvenser inden for mund- og klovsygevirus (FMDV) 5′ utranslateret region, men uden for cre/bus kan øge VPg-uridylyleringsaktiviteten. Desuden har vi vist, at FMDV 3C-proteinet alene kan erstatte 3CD, omend mindre effektivt. Hertil kommer VPg-prækursorerne, 3B33C og 3B1233C, kan fungere som substrater for uridylylering i fravær af tilsat 3C eller 3CD. Rester i FMDV 3C-proteinet involveret i interaktion med cre/bus RNA er blevet identificeret og er placeret på forsiden af ​​proteinet modsat det katalytiske sted. Disse rester i 3C er også essentielle for VPg-uridylyleringsaktivitet og effektiv virusreplikation.

Familien Picornaviridae omfatter vigtige patogener hos mennesker og andre pattedyr, f.eks. poliovirus (PV), human rhinovirus (HRV) og mund- og klovsygevirus (FMDV). Picornavirus-genomer er positive-sense RNA-molekyler på ca. 8 kb, der fungerer både som mRNA'er (til at producere de virus-kodede proteiner) og som skabeloner til produktion af nye RNA-transkripter (4, 32). Det genomiske RNA er uden kappe (jf. eukaryote cellulære mRNA'er), men er forbundet ved sin 5′ ende til det viruskodede peptid VPg (eller 3B). Alle picornavirus genomer har en 5′-terminal sekvens af VPgpUpU…, og denne er afledt af brugen af ​​VPg som en peptidprimer til syntesen af ​​RNA. Vedhæftning af dette peptid til RNA'et sker via en Tyr (Y)-rest og udføres af den virale RNA-polymerase (3D) pol ). For PV, HRV og FMDV er det blevet vist, at uridylyleringen af ​​VPg kan opnås in vitro ved at bruge renset VPg (som et syntetisk peptid) med 3D pol , precursoren 3CD, UTP og en RNA-skabelon, der inkluderer en stamløkkestruktur, der ofte kaldes en cis-virkende replikationselement (cre) (15, 29, 33). Denne reaktion producerer VPgpU og VPgpUpU [samlet betegnet VPgpU(pU)]. Det var blevet forventet, at sådanne primere ville fungere til dannelsen af ​​både positiv- og negativ-sense RNA'er (32). Uventet viser eksperimenter i et in vitro-replikationssystem, at PV cre er ikke påkrævet til negativ-sense RNA-syntese (19, 26, 28). Men for nylig er det blevet rapporteret, at visse mutationer i coxsackievirus B3 cre har påvirket både positiv- og negativ-streng RNA-syntese (43). Således er mekanismen involveret i initieringen af ​​negativ-sense RNA-syntese stadig ikke løst.

Unikt koder og bruger FMDV tre forskellige VPg-peptider, som er 23 eller 24 aminosyrer lange (21). Hver af FMDV VPg'erne kan uridylyleres in vitro, selvom VPg3 (3B3) synes at være det mest effektive substrat (29). Det er interessant, at modifikation af kun den VPg3-kodende sekvens inden for konteksten af ​​det infektiøse cDNA i fuld længde (FL) resulterede i produktionen af ​​et ikke-infektiøst RNA-transkript (13).

Den første cre identificeret i picornavirus-RNA var inden for sekvensen, der koder for 1D (VP1)-proteinet af HRV type 14 (HRV-14). Dette element har vist sig at være nødvendigt i form af RNA til replikation af det virale RNA (24, 25). Efterfølgende er lignende elementer blevet identificeret i andre picornavirus-genomer (15, 17, 22). Hver af disse cre strukturer (ca. 50 til 60 nukleotider [nt] i længden) inkluderer et konserveret sekvensmotiv, AAACA, placeret i en løkke for enden af ​​en stabil stilk. Disse elementer forekommer forskellige steder i forskellige picornavirus genomer cre strukturer fra HRV-14, HRV-2, cardiovirus og PV er inden for de kodende regioner for henholdsvis 1D, 2A, 1B og 2C (15, 22, 25, 33). Enestående, FMDV cre er placeret inden for den 5′ utranslaterede region (5′ UTR) af RNA'et (23), lige opstrøms for det interne ribosomindgangssted (IRES). Det cre strukturer kan flyttes uden blokeringsfunktion (18, 23).

A 1 A 2 A 3 CA-motivet inden for cre fungerer som skabelonen for uridylyleringen af ​​VPg, og inden for dette motiv er A 1 nukleotidet absolut essentielt for reaktionen, mens modifikation af enten A 2 eller A 3 hæmmer det alvorligt (35). Det er blevet vist, at en “slideback” mekanisme er involveret i uridylyleringen af ​​PV VPg, og at A 1 nukleotidet fungerer som skabelonen for tilføjelsen af ​​begge uridylgrupper til peptidet. Data om kravene til dette motiv inden for FMDV-elementet er i overensstemmelse med den samme mekanisme (29). For nylig er strukturen af cre fra HRV er blevet bestemt ved hjælp af kernemagnetisk resonans (40), men overraskende nok var AAACA-motivet ikke særlig eksponeret. Genetiske undersøgelser har vist, at FMDV cre kan fungere i trans (41), og derfor er det blevet foreslået, at dette element skal betegnes som et 3B-uridylyleringssted (bus). PV'en cre kan også fungere i trans inden for in vitro assays (19), og nyere data fra Crowder og Kirkegaard (11) viste, at mutationer inden for PV cre kan hæmme PV-replikation i en trans-dominerende måde i celler.

Arten af ​​den væsentlige rolle for 3CD i uridylyleringsreaktionen er ikke helt klar. Det er velkendt, at PV 3CD kan binde til RNA og er i stand til at interagere med den 5′-terminale kløverbladsstruktur på PV RNA (1) og også specifikt med PV cre (48). Specifikke rester inden for en konserveret KFRDI (Lys-Phe-Arg-Asp-Ile) sekvens, som er nødvendige for interaktion af picornavirus 3C proteiner med RNA, er blevet identificeret (1, 5, 27, 44). Det er også blevet vist, at PV 3CD's rolle i uridylyleringsreaktionen kan opfyldes af 3C alene, selvom reaktionen er mindre effektiv (31). Strukturerne af adskillige picornavirus 3C-proteiner er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi, inklusive den, der kodes af FMDV (5, 7, 27), men i øjeblikket er der ikke rapporteret nogen struktur for et 3CD-protein. RNA-bindende regioner af PV- og hepatitis A-virus (HAV) 3C-proteaser er blevet kortlagt til sekvenser på forsiden af ​​molekylet modsat det katalytiske aktive sted (5, 27, 33, 47). Modifikation af både R84 og I86 inden for K 82 FRDI 86-motivet af PV 3C-proteasen blokerede proteinets evne til at binde 𠇌loverleaf” RNA'et og til at understøtte PV VPg-uridylylering (1, 33). Vi har nu undersøgt rollerne af sekvenser inden for FMDV 3C-proteinet, der er nødvendige for uridylylering af FMDV VPg in vitro. Vi har identificeret individuelle aminosyrer på overfladen af ​​FMDV 3C-proteinet, der er kritiske for uridylylering, og som også modificerer proteinets interaktion med cre/bus. Derudover har vi undersøgt arten af ​​RNA-skabelonen involveret i uridylyleringsreaktionen og har vist, at tilstedeværelsen af ​​FMDV IRES i RNA-transkriptet øger skabelonaktiviteten af ​​den tilstødende cre/bus struktur.


Enzymatiske egenskaber af Calicivirus RdRps

Polymerase-fidelitet, replikationshastighed og evolutionære hastigheder

Calicivirus RdRps såvel som RdRps af andre RNA-vira er kendt for at være fejltilbøjelige enzymer, fordi de mangler korrekturlæsningsaktiviteterne fra mange DNA-polymeraser. Der opstår ca. én fejl pr. replikationscyklus for RNA-vira sammenlignet med én fejl pr. 300 cyklusser for DNA-vira (Drake, 1991, 1993). Det er noget udfordrende at sammenligne undersøgelser med forskellige fejlrapporteringsenheder, men visse tendenser viser sig. Den gennemsnitlige fejlrate for HCV (familie Flaviviridae) er 3,8 × 10 -5 , målt som substitutioner pr. nukleotid pr. infektionscyklus (s/n/c) (Sanjuán og Domingo-Calap, 2016 Selisko et al., 2018), og fejlfrekvensen af poliovirus RdRp varierer fra 7 × 10-4 til 5,4 × 10-3, som bestemt af forholdet mellem ikke-komplementære nukleotiders inkorporering og det totale antal nukleotider (Ward et al., 1988). Lignende RdRp-fejlrater blev bestemt for flere virus i familien Caliciviridae, f.eks. 6,8 × 10-4 for MNV, 1,6 × 10-4 for sapovirus GI og 9,0 × 10-4 nukleotidsubstitutioner/sted for norovirus GII.4 (Bull et al., 2010b).

RNA-afhængige RNA-polymeraseegenskaber, såsom troskab og replikationshastighed, er vigtige faktorer, der former virusudviklingen. For eksempel havde RdRps fra norovirus GII.4-stammer højere mutationshastigheder (bestemt vha. in vitro fidelity assays) sammenlignet med dem af de nært beslægtede, men sjældnere påviste GII.b og GII.7 stammer (5,5𠄹.1 × 10 -4 substitutioner pr. sted for GII.4 RdRps vs. 1,5 × 10 -4 og 2,2 × 10 -5 substitutioner pr. sted for henholdsvis GII.b og GII.7). Interessant nok viste GII.4-linjen en cirka 1,7 gange højere udviklingshastighed af capsidsekvenser og en højere frekvens af ikke-synonyme ændringer sammenlignet med ikke-pandemiske norovirus-stammer (Bull et al., 2010a). Endvidere har Mahar et al. (2013) rapporterede, at erhvervelsen (ved rekombination) af nye GII.3 RdRp-varianter med højere mutationsrater kan øge den genetiske diversitet og forbedre den overordnede kondition af virale populationer under selektivt pres. Sammenlagt ser en lav troskabsrate ud til at korrelere med en højere evolutionær rate.

Replikationshastigheden af ​​en virus er en anden determinant for viral fitness, da vira med en øget replikationshastighed kan producere flere kopier af deres genom, hvilket ville resultere i flere varianter, selvom RdRp-fejlraten forbliver den samme. For eksempel havde RdRps fra de 2006 GII.4 pandemiske stammer en højere nukleotid-inkorporeringshastighed (dvs. de replikerede hurtigere) end de rekombinante GII.4 RdRps fra tidligere udbrud og den US95/96-lignende pandemiske GII.4-stamme, selvom fejlprocenterne var meget ens. Den observerede stigning i inkorporeringshastigheden er blevet forbundet med fremkomsten af ​​en mutation uden for det aktive sted, dvs. en Lys291 til Thr substitution i RdRp fingerdomænet (Bull et al., 2010a). Således ser høj mutations- og/eller replikationshastighed inden for GII.4-linjen ud til at korrelere med udviklingen af ​​pandemiske stammer. Imidlertid korrelerer høje replikationshastigheder ikke altid med en høj overordnet kondition af en virus, hvilket tyder på, at hastigheden skal afbalanceres med passende mutationshastigheder. For eksempel har GII.7 norovirus-slægten, på trods af en høj replikationshastighed, en lav mutationshastighed og begrænset geografisk spredning (Bull et al., 2010a). Det er muligt, at den hastighed, hvormed denne særlige virus replikerede, ikke var hurtig nok til at balancere dens begrænsede evne til at producere nye varianter gennem inkorporering af mutationer.

Bidraget fra RdRp til den evolutionære hastighed af calicivira blev endnu mere tydeligt med den nylige succes med rekombinante GII.2 og GII.4 vira, der erhvervede en ny polymerasevariant. For eksempel resulterer det genopståede rekombinante norovirus GII.P16-GII.2, der adskiller sig fra tidligere GII.P16-GII.2-stammer med 5 aminosyrer i RdRp (Ruis et al., 2017), i høje virusbelastninger i fæces, har en relativt høj evolutionær hastighed (5,5 × 10 -3 substitutioner/sted/år) og har hurtigt spredt sig over hele verden (Ao et al., 2018 Cheung et al., 2019). Det er blevet foreslået, at aminosyreændringerne i det nye RdRp påvirker de kinetiske egenskaber og enzymets pålidelighed, men de nøjagtige mekanistiske detaljer forbliver ukendte.

Genetiske rekombinationshændelser er også blevet observeret mellem forskellige lagovira. RHDV2, oprindeligt en virus med moderat virulens og begrænset geografisk rækkevidde (Le Gall-Reculé et al., 2013), ser ud til at have udviklet sig til en mere virulent virus (Capucci et al., 2017), en ændring, der menes at være i det mindste delvist en konsekvens af rekombination med andre lagovira (Lopes et al., 2015). Nogle af disse rekombinante vira viste sig at besidde de ikke-strukturelle proteiner fra benigne kanin calicivirus Australia-1 (RCV-A1)-lignende vira (Lopes et al., 2015 Hall et al., 2018). RHDV og RCV-A1 har evolutionære rater på henholdsvis 2,8 × 10 -3 og 5,0 × 10 -3 substitutioner/sted/år (Eden et al., 2015 Mahar et al., 2016). Den højere evolutionære hastighed af RCV-A1 korrelerer med en højere hastighed af dens RdRp, som bestemt af in vitro analyser (Urakova et al., 2016). Det er fristende at spekulere i, at RHDV2 kunne have erhvervet en relativt hurtig polymerase, hvilket kan forklare dens øgede virulens og tilsyneladende evolutionære succes. Inden for 18 måneder efter dets ankomst erstattede RHDV2 stort set endemiske RHDV-stammer i Australien (Mahar et al., 2017).

Genereringen af ​​en genetisk meget forskelligartet pulje af genomer giver en evolutionær fordel, fordi en mangfoldig viruspopulation lettere kan tilpasse sig selektive pres (Domingo, 2002 Lauring og Andino, 2010). Hvis diversiteten er resultatet af en højere fejlrate, kan dette også øge sandsynligheden for at erhverve skadelige mutationer, og det er derfor blevet foreslået, at de fleste RNA-vira replikerer på kanten af ​​en fejltærskel, der er bestemt af et komplekst samspil af flere parametre såsom genomstørrelse, fejlrater og replikationshastighed (Duffy et al., 2008). Som sådan bør det ikke komme som en overraskelse, at både stigninger og fald i RdRp-troskab kan påvirke viral fitness (Pfeiffer og Kirkegaard, 2005 Xie et al., 2014 Arias et al., 2016 Agol og Gmyl, 2018).

Effekter af temperatur, pH og saltforhold på RdRp ydeevne

Betingelserne for en optimal ydeevne af calicivirus RdRps blev bestemt for vira fra slægterne Norovirus, Sapovirus, og Lagovirus (Tabel 3). Aktiviteten af ​​viral RdRps er temperaturafhængig, selvom den optimale temperatur ikke nødvendigvis er værtens krop. I tidlige undersøgelser blev den højeste sapovirus RdRp-aktivitet påvist ved 37ଌ (Fullerton et al., 2007). Nyere undersøgelser indikerer dog, at mange calicivirus RdRps virker i et miljø, der ikke tillader maksimal ydeevne. Eksempelvis udviste et humant norovirus RdRp en højere aktivitet ved 30 end ved 37ଌ iflg. in vitro assays (Rohayem et al., 2006a). Desuden, når et bredere temperaturområde blev undersøgt (dvs. 5, 25, 37, 55, 65 og 75ଌ) med humant norovirus og sapovirus RdRps, var aktiviteten højest ved 25ଌ, og kun omkring 50 % af optimal enzymatisk aktivitet blev udvist ved 37ଌ (Bull et al., 2010b). Ydermere viste norovirus og sapovirus RdRps kun ca. 20% af deres optimale aktivitet ved 5ଌ og kun ca. 1% ved 55ଌ. Ingen aktivitet blev påvist ved 65 eller 75ଌ for nogen af ​​RdRps undtagen sapovirus RdRp, som stadig udviste 13 % af den optimale aktivitet ved 65ଌ (Bull et al., 2010b). Interessant nok er den optimale temperatur for nogle hvis ikke alle lagovira højere end den for humane norovirus og sapovirus. Ved hjælp af rekombinante proteiner blev det fundet, at RdRps af den ikke-patogene RCV og den højpatogene RHDV klarede sig bedst mellem 40 og 45ଌ (Urakova et al., 2016), en egenskab, der kan forklares som en tilpasning af kanin calicivirus til deres værter, da kropstemperaturen hos raske kaniner varierer fra 38,3 til 39,4ଌ. Desuden hæver feberen forbundet med kaninblødning ofte kropstemperaturen til 42ଌ (Strive et al., 2010), men denne temperatur er ikke høj nok til at bremse aktiviteten af ​​RHDV RdRp (Urakova et al., 2016) ). Årsagen til, at andre calicivira end lagovira ser ud til at have et temperaturoptimum, der er forskelligt fra værtens kernekropstemperatur, er på nuværende tidspunkt ukendt, og yderligere forskning er påkrævet for at besvare dette spørgsmål.

Tabel 3. Enzymatiske egenskaber af calicivirus RdRps.

Den optimale pH for kanin calicivirus RdRps blev fundet at være 8,5, hvilket er højere end for norovirus RdRps (7,0𠄸,0) (Bull et al., 2010b Urakova et al., 2016). For optimal katalytisk funktion kan norovirus og lagovirus RdRps anvende enten Mn 2+ eller Mg 2+, men ikke Fe 2+ (Vazquez et al., 1998 Rohayem et al., 2006a Urakova et al., 2016). Sapovirus RdRp viste en højere aktivitet med Mn2+, men det var også aktivt, når Mg2+ blev tilsat som en cofaktor til reaktionen, hvilket indikerer en vis fleksibilitet i brugen af ​​cofaktorer (Fullerton et al., 2007).


Resultater

Strategi for ekspression af de native former for NV genomisk og subgenomisk RNA. To arter af NV cDNA, genomisk og subgenomisk (fig. 1B ), blev brugt, fordi sådanne virale RNA'er er blevet påvist i celler inficeret med animalske calicivirus (5). Konstruktion af det subgenomiske NV-cDNA anvendt til dette eksperiment var baseret på nukleotidsekvenserne af subgenomisk RNA fundet i animalske calicivira (5). Genomiske og subgenomiske NV-cDNA'er med poly(A)-kanaler blev placeret nedstrøms for T7-promotoren og opstrøms for hepatitis delta-virus-ribozymet (HδR) og T7 RNA Pol-termineringssignalet (T7ϕ) for at muliggøre generering af transkripter med den nøjagtige 5′ og 3'-ender af NV-genomet (fig. 1B ). Fordi initiering af transkription af plasmidkonstruktionerne under kontrol af T7-promotoren er ved et G-nukleotid (19), og det initiale nukleotid for NV-RNA er et G, sker transkription af NV-cDNA'er ved oprindelsen af ​​NV-insertionen. Autokatalytisk spaltning af primære transkripter forekommer mellem det sidste A af poly(A)-regionen og det første G af HδR-stedet, hvilket resulterer i virale RNA'er, der ender med en poly(A)-hale.

Ekspression af genomisk RNA i pattedyrceller. For at bestemme, om den genomiske cDNA-konstruktion af NV er en funktionel infektiøs klon, blev NV-genomisk RNA udtrykt i 293T-celler ved anvendelse af MVA/T7-systemet. Ekspression af de virale ikke-strukturelle proteiner Pro og RNA-afhængige RNA Pol blev påvist ved radioimmunpræcipitation og immunfluorescens i celler, der udtrykker genomisk RNA (fig. 2)EN ).

Ekspression og replikation af genomisk NV-RNA i pattedyrsceller. 293T-celler blev inficeret med MVA/T7 og derefter transficeret med plasmider, der koder for NV-cDNA'er. (EN) Påvisning af ikke-strukturelle og strukturelle NV-proteiner i celler, der udtrykker NV-RNA ved radioimmunpræcipitation (Venstre) og immunfluorescens (Ret) med antisera mod proteinerne. Radiomærkede NV-proteiner syntetiseret af in vitro oversættelsen blev behandlet parallelt.Molekylstørrelsesmarkører (kilodalton) er til højre. Pile fremhæver NV-proteinerne. (B) Påvisning af subgenomisk RNA syntetiseret i celler, der udtrykker genomisk RNA. Poly(A) + RNA, isoleret ved 4-12 timer pt, og blev udsat for Northern blotting. In vitro transkripter af subgenomisk RNA blev analyseret parallelt. Pil angiver subgenomisk RNA. RNA-størrelsesmarkører (nukleotider) er til venstre.

Fordi ORF1 af NV-genomet koder for et ikke-strukturelt polyprotein (fig. 1 EN ) der spaltes ind i de tilsvarende ikke-strukturelle proteiner af Pro (4, 20-25), påvisning af de korrekte størrelser af Pro og RNA Pol, placeret i den yderste 3'-ende af ORF1, ved radioimmunpræcipitation indikerer, at det ikke-strukturelle polyprotein blev oversat fra det genomiske RNA udtrykt i 293T-celler, og de individuelle ikke-strukturelle proteiner blev efterfølgende genereret ved spaltning med en biologisk aktiv Pro. Både Pro og RNA Pol blev også påvist ved immunfluorescens i cytoplasmaet af de udtrykkende celler.

Ekspression af det virale capsidprotein VP1 blev også påvist ved radioimmunpræcipitation og immunfluorescens (fig. 2) EN ). I animalske calicivira, såsom feline calicivirus (FCV) og kanin hæmoragisk sygdomsvirus, tjener subgenomisk RNA transskriberet fra genomisk RNA som skabelonen for translation af VP1 (5). In vitro translation af genomisk RNA producerede ikke noget VP1 (fig. 6, som er offentliggjort som understøttende data på PNAS-webstedet), hvilket indikerer, at VP1 som påvist i genomiske RNA-udtrykkende celler ikke blev genereret af en intern initieringsbaseret translationsmekanisme. Således antydede påvisning af VP1 i celler, der udtrykker genomisk RNA, at det blev translateret fra subgenomisk RNA, som blev transskriberet fra replikeret genomisk RNA af de udtrykte NV ikke-strukturelle proteiner. Ekspression af poly(A)+ subgenomisk RNA i de genomiske RNA-udtrykkende celler blev undersøgt 4, 6, 8, 10 og 12 timer efter transfektion (pt) ved Northern blot-analyse med en positiv strengspecifik RNA-probe svarende til VP1-regionen af ​​NV-genomet (fig. 2B ). Genomisk RNA (7,6 kb) blev først påvist ved 4 timer pt (bane 1), og niveauerne af genomisk RNA faldt over tid (bane 2 til 5). Kør som kontroller, subgenomiske cDNA-transficerede celler (bane 7) og in vitro transkripter af subgenomisk cDNA (bane 8) gav to lidt forskellige størrelser bånd på 2,3 kb og 2,5 kb, hvori det subgenomiske RNA manglede og indeholdt henholdsvis HδR og T7ϕ. I celler transficeret med genomisk cDNA blev ekspression af det forventede 2,3 kb subgenomiske RNA først påvist ved 6 timer pt (bane 2). Subgenomisk RNA blev ikke påvist efter 4 timer pt trods ekspression af genomisk RNA (bane 1) og var fraværende i mocktransficerede celler (bane 6). Subgenomisk RNA var ikke et nedbrydningsprodukt eller et mellemprodukt af genomisk RNA, fordi ekspressionsniveauet af subgenomisk RNA faldt mellem 6 og 8 timer pt (bane 2 og 3), forblev derefter relativt konstant indtil 12 timer pt (bane 3-5) på trods af faldende niveauer af genomisk RNA observeret over tid (bane 3 til 5). 5'-endekortlægning af det subgenomiske RNA ved primerforlængelse indikerede, at sekvensen af ​​subgenomisk RNA påvist i celler, der udtrykker genomisk RNA, begyndte ved det konserverede transkriptionsinitieringssted for subgenomisk calicivirus-RNA (5) (fig. 5). Derudover blev det subgenomiske RNA udtrykt fra genomisk RNA ekstraheret fra en agarosegel og blev derefter udsat for 5'-RACE-analyse (fig. 7, som er offentliggjort som understøttende information på PNAS-webstedet). 5'-endesekvensen af ​​det subgenomiske RNA begyndte ved det konserverede transkriptionssted af det subgenomiske RNA fra calicivirus, som har lighed med de første fire nukleotider af genomisk RNA (GTAA), efterfulgt af den første AUG i ramme af ORF2. Vi undersøgte også ekspressionen af ​​subgenomisk RNA fra genomisk RNA, hvor RNA Pol blev inaktiveret ved deletion af GDD-aminosyresekvensen, som er det bevarede aktive sted af RNA Pols. Ekspression af subgenomisk RNA blev ikke påvist i celler, der udtrykker genomisk RNA med en inaktiveret RNA Pol (fig. 8, som er offentliggjort som understøttende information på PNAS-webstedet). Disse observationer indikerer, at det detekterede subgenomiske RNA blev genereret ved transkription fra genomisk RNA og ikke skyldtes promiskuøs T7-transkription (fig. 9, som er offentliggjort som understøttende information på PNAS-webstedet).

Samlet set indikerer påvisning af capsid VP1-protein og subgenomisk RNA i celler, der udtrykker genomisk RNA, at replikation af det genomiske RNA udtrykt af MVA/T7-systemet forekom, dvs. subgenomisk RNA genereret fra genomisk RNA af de udtrykte og funktionelle ikke-strukturelle proteiner, og var oversat til VP1. En NV-cDNA-klon, der er en biologisk funktionel infektiøs klon, er således blevet konstrueret, og pattedyrsceller er i stand til at replikere denne klon.

Pakning af viralt genomisk RNA i viruspartikler. Tomme NV-viruspartikler, som morfologisk og antigent ligner vildtype-virioner, kan produceres, når de virale strukturelle proteiner VP1 og VP2 udtrykkes i insekt Sf-9-celler ved brug af rekombinante baculovira indeholdende subgenomisk cDNA (8). Vi udtrykte den native form af det virale subgenomiske RNA i pattedyrsceller og undersøgte, om viruspartikler blev genereret. Viruspartikler afledt af subgenomiske RNA-udtrykkende celler blev oprenset fra kultursupernatanter ved isopycnisk CsCl-gradientcentrifugering efterfulgt af fraktionering, og de formodede viruspartikler blev pelleteret fra hver fraktion til analyse. Både VP1 og VP2 blev påvist i den samme fraktion ved Western blotting (fig. 3EN , fraktion 4-6) en top af cosedimentering af VP1 og VP2 blev påvist i fraktion 5. Tilstedeværelsen af ​​viruspartikler i fraktion 5 blev bekræftet ved negativ farveelektronmikroskopi (fig. 3B ). Disse resultater giver bevis for, at ekspression af en naturlig form af NV subgenomisk RNA i pattedyrceller genererer viruspartikler sammensat af både VP1 og VP2.

Generering af viruspartikler fra celler, der udtrykker subgenomisk RNA. Viruspartikler blev isoleret fra kultursupernatanterne ved isopycnisk CsCl-gradientcentrifugering, og partikler i individuelle gradientfraktioneringer blev sedimenteret. (EN) Tilstedeværelsen af ​​viruspartikler i hver fraktion blev undersøgt ved Western blotting med anti-rNV hyperimmunserum, der reagerer med VP1 (18) (Øverst) og anti-VP2 antistof (24) (Nederste). Som en positiv kontrol blev viruspartikler produceret af baculovirusekspressionssystemet (24) analyseret parallelt. Pile angiver påviste virale proteiner. Størrelsesmarkører (kilodalton) er til højre. (B) Elektronmikrofotografi af negativt farvede oprensede viruspartikler fra fraktion 5. (Skala søjle: 100 nm.)

Vi søgte derefter at bestemme, om viralt genomisk RNA var pakket ind i viruspartiklerne produceret af pattedyrceller, der udtrykker viralt RNA ved anvendelse af MVA/T7-systemet. Til dette formål blev viruspartikler, isoleret fra gradientfraktioner som beskrevet ovenfor, behandlet med DNase I og RNase A for at fjerne plasmid-DNA eller viralt RNA, der kan være uspecifikt bundet til partikeloverfladen. Viralt RNA blev derefter ekstraheret fra viruspartikler og kvantificeret ved real-time RT-PCR. For at detektere genomisk RNA blev der anvendt primere, der er specifikke for RNA Pol-regionen, til stede i genomisk RNA, men fraværende fra subgenomisk RNA. Når viruspartikler blev fraktioneret fra celler, der udtrykker genomisk RNA alene, blev et svagt positivt signal, der indikerer inkorporering af viralt genomisk RNA i viruspartikler, påvist i fraktion 8 (data ikke vist). Tilstedeværelsen af ​​capsidprotein VP1 kunne imidlertid ikke påvises i fraktion 8 på grund af detektionsgrænserne for Western blotting. Ekspressionsniveauet af VP1 i genomiske RNA-udtrykkende celler var meget lavere end i subgenomiske RNA-udtrykkende celler (fig. 2) EN ). For at øge ekspressionen af ​​VP1- og VP2-capsidproteiner og øge sandsynligheden for at pakke det virale genom, blev viruspartikler derfor isoleret fra celler, der co-udtrykker genomisk og subgenomisk RNA. Et positivt signal, der indikerer inkorporering af viralt genomisk RNA i viruspartikler, blev igen påvist i fraktion 8 (fig. 4)EN ). Dette positive signal blev påvist i nærvær af revers transkriptase, men ikke i dets fravær, hvilket indikerer, at dette signal skyldtes inkorporeringen af ​​viralt genomisk RNA, men ikke NV cDNA. Capsidproteinet VP1 blev også påvist i fraktion 8 ved Western blotting med hyperimmun anti-NV-serum (fig. 4)EN ). Viruspartikler blev detekteret i fraktionerne 2-5 ved negativ farveelektronmikroskopi (data ikke vist), men et positivt signal, der indikerer, at pakningen af ​​genomisk RNA ikke blev påvist i disse fraktioner, hvilket indikerer, at disse viruspartikler var tomme. Disse resultater indikerer, at en lille procentdel af viruspartikler kunne pakke genomisk RNA, og tætheden af ​​disse partikler blev flyttet fra fraktioner 2-5 (lav tæthed, hvor tomme partikler bånd) til fraktion 8 (høj tæthed). Vi undersøgte også inkorporering af viralt RNA i viruspartikler, genereret under to forskellige ekspressionsbetingelser (subgenomisk RNA alene eller både subgenomisk og genomisk RNA), ved brug af primere, der er specifikke for capsidregionen, der kan detektere både genomisk og subgenomisk RNA. Igen blev et positivt signal påvist i fraktion 8 i partikler genereret ved co-udtrykkelse af genomisk og subgenomisk RNA (fig. 4)Bi ). Viruspartikler genereret ved ekspression af subgenomisk RNA alene viste imidlertid ikke noget positivt RNA-signal (fig. 4)Bii ). Selvom høje niveauer af capsidprotein blev påvist i fraktionerne 2-5 (fig. 4Bii ), viste viruspartiklerne sig tomme ved negativ farveelektronmikroskopi (data ikke vist). Således var partikler genereret ved ekspression af subgenomisk RNA alene tomme viruspartikler, der manglede det virale RNA. Viruspartikler indeholdende det genomiske RNA genereret ved co-ekspression af genomisk og subgenomisk RNA blev isoleret ved en CsCl-densitet på 1,32-1,36 g/ml, svarende til de tidligere rapporterede tætheder for NV oprenset fra afføring (10, 26-29). I modsætning hertil havde de tomme viruspartikler genereret ved ekspression af subgenomisk en CsCl-densitet på 1,27-1,29 g/ml. Således var tætheden af ​​den fraktion, der indeholdt det genomiske RNA, højere end densiteten for tomme viruspartikler og tæt på den for viruspartikler påvist i human afføring. Disse data indikerer kraftigt, at viralt RNA er inkorporeret i viruspartikler genereret ved co-udtrykkelse af genomisk og subgenomisk RNA.

Inkorporering af viralt RNA i viruspartikler. Viruspartikler blev isoleret fra kultursupernatanterne af celler, der udtrykker subgenomisk RNA eller co-udtrykker både genomisk og subgenomisk RNA, efterfulgt af sedimentering som beskrevet i fig. 3. De sedimenterede partikler fra individuelle fraktioner blev behandlet med DNase I og RNase A, og nukleinsyre blev ekstraheret og udsat for kvantitativ realtids-RT-PCR, udført med eller uden revers transkriptase. Kopiantallet af viralt RNA til stede i hver fraktion blev bestemt ved sammenligning med en standardkurve, og resultaterne er plottet mod tætheden. Hver fraktion blev også undersøgt ved Western blotting for tilstedeværelsen af ​​VP1, og resultaterne er vist i indsættelserne. (EN) Påvisning af genomisk RNA inkorporeret i viruspartikler genereret ved co-ekspression af genomisk og subgenomisk RNA ved anvendelse af primere svarende til Pol-regionen. (B) Påvisning af subgenomisk RNA inkorporeret i viruspartikler genereret ved samekspression af genomisk og subgenomisk RNA (jeg) eller subgenomisk RNA alene (ii) ved at anvende primere svarende til capsidregionen.


En virus, hvis infektiøse virioner indeholder genomet i en enkeltstrenget, messenger-sense RNA-form.

En virus, hvis infektiøse virioner indeholder genomet i en enkeltstrenget, anti-messenger-sense RNA-form.

Et DNA-plasmid, der replikeres ved transkription og revers transkription af et RNA-mellemprodukt.

Mærkning af RNA ved at erstatte substratet UTP med 5-brom-UTP (BrUTP). Det mærkede RNA kan lokaliseres ved hjælp af elektronmikroskopi efter immunogold-mærkning med et antistof rettet mod BrU.

Et stedspecifikt, programmeret skift af nogle oversættende ribosomer fra en læseramme til en anden, hvilket gør det muligt at udvide en brøkdel af translationsprodukter i den nye ramme.

Programmeret translation af nogle ribosomer gennem et termineringskodon, hvilket tillader en brøkdel af translationsprodukter at blive udvidet ud over det normale stopsted.