Information

8: Transskription - Biologi

8: Transskription - Biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Selvom DNA er et fremragende medium til lagring af information, gør netop den egenskab, der gør det så stabilt og iboende selvkorrigerende - at være dobbeltstrenget - det også uhåndterligt at bruge den genetiske information til at lave cellekomponenter. Da de informative dele af molekylet (de nitrogenholdige baser) er låst inde i stigen, kræver læsning af den den energisk dyre opgave at bryde alle de hydrogenbindinger, der holder de to strenge sammen. At gøre det for hver enkelt kopi af hvert protein, som cellen har brug for, ville ikke kun tage en masse energi, men en masse tid. I stedet skal der være en mekanisme til at tage informationen fra DNA én gang (eller et par gange), og så lave mange kopier af et protein fra den enkelte information. Den mekanisme er transskription.

Thumbnail: Forenklet diagram over mRNA-syntese og -behandling. (CC BY 3.0 - uporteret ; Kelvinsong).


8: Transskription - Biologi

Ved slutningen af ​​dette afsnit vil du være i stand til at:

  • Angiv trinene i eukaryot transkription
  • Diskuter RNA-polymerasers rolle i transkription
  • Sammenlign og kontrast de tre RNA-polymeraser
  • Forklar betydningen af ​​transskriptionsfaktorer

Prokaryoter og eukaryoter udfører grundlæggende den samme transkriptionsproces med nogle få vigtige forskelle. Den vigtigste forskel mellem prokaryoter og eukaryoter er sidstnævntes membranbundne kerne og organeller. Med generne bundet i en kerne skal den eukaryote celle være i stand til at transportere sit mRNA til cytoplasmaet og skal beskytte sit mRNA mod nedbrydning, før det translateres. Eukaryoter anvender også tre forskellige polymeraser, der hver transkriberer en anden undergruppe af gener. Eukaryote mRNA'er er normalt monogene, hvilket betyder, at de specificerer et enkelt protein.


Adgangsmuligheder

Få fuld journaladgang i 1 år

Alle priser er NETTOpriser.
Moms tillægges senere i kassen.
Skatteberegningen vil blive afsluttet under kassen.

Få tidsbegrænset eller fuld artikeladgang på ReadCube.

Alle priser er NETTOpriser.


Adelman, K. & Lis, J. T. Promotor-proksimal pause af RNA-polymerase II: nye roller i metazoer. Nat. Rev. Genet. 13, 720–731 (2012).

Fuda, N. J., Ardehali, M. B. & Lis, J. T. Definition af mekanismer, der regulerer RNA-polymerase II-transkription in vivo. Natur 461, 186–192 (2009).

Proudfoot, N. J. Transkriptionel terminering hos pattedyr: standsning af RNA-polymerase II-juggernauten. Videnskab 352, aad9926 (2016).

Eick, D. & Geyer, M. RNA-polymerase II carboxy-terminal domæne (CTD) kode. Chem. Rev. 113, 8456–8490 (2013).

Harlen, K. M. & Churchman, L. S. Koden og videre: transkriptionsregulering af RNA-polymerase II-carboxy-terminalt domæne. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 263–273 (2017).

Zaborowska, J., Egloff, S. & Murphy, S. Pol II CTD: nye drejninger i halen. Nat. Struktur. Mol. Biol. 23, 771–777 (2016).

Jeronimo, C., Collin, P. & Robert, F. RNA-polymerase II CTD: den stigende kompleksitet af et proteindomæne med lav kompleksitet. J. Mol. Biol. 428, 2607–2622 (2016).

Bentley, D. L. Kobling af mRNA-behandling med transkription i tid og rum. Nat. Rev. Genet. 15, 163–175 (2014).

Hsin, J. P. & Manley, J. L. RNA-polymerase II CTD koordinerer transkription og RNA-behandling. Genes Dev. 26, 2119–2137 (2012).

Herzel, L., Ottoz, D. S. M., Alpert, T. & Neugebauer, K. M. Splejsning og transskription berøringsbase: co-transkriptionel spliceosom samling og funktion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 637–650 (2017).

Marzluff, W. F. & Koreski, K. P. Fødsel og død af histon-mRNA'er. Trends Genet. 33, 745–759 (2017).

Duronio, R. J. & Marzluff, W. F. Koordinering af cellecyklus-reguleret histon-genekspression gennem samling og funktion af Histon Locus Body. RNA Biol. 14, 726–738 (2017).

Sullivan, K.D., Steiniger, M. & Marzluff, W. F. Et kernekompleks af CPSF73, CPSF100 og Symplekin kan danne to forskellige spaltningsfaktorer til behandling af poly(A)- og histon-mRNA'er. Mol. Celle 34, 322–332 (2009).

Kohn, M., Ihling, C., Sinz, A., Krohn, K. & Huttelmaier, S. Y3** ncRNA'et fremmer 3'-endebehandlingen af ​​histon-mRNA'er. Genes Dev. 29, 1998–2003 (2015).

Pirngruber, J. et al. CDK9 styrer H2B monoubiquitinering og kontrollerer replikationsafhængig histon mRNA 3'-ende behandling. EMBO Rep. 10, 894–900 (2009).

Narita, T. et al. NELF interagerer med CBC og deltager i 3′-endebehandling af replikationsafhængige histon-mRNA'er. Mol. Celle 26, 349–365 (2007).

Saldi, T., Fong, N. & Bentley, D. L. Transkriptionsforlængelsehastighed påvirker begyndende histon-præ-mRNA-foldning og 3'-endebehandling. Genes Dev. 32, 297–308 (2018).

Hsin, J. P., Sheth, A. & Manley, J. L. RNAP II CTD phosphoryleret på threonin-4 er påkrævet til histon mRNA 3'-endebehandling. Videnskab 334, 683–686 (2011).

Medlin, J. et al. P-TEFb er ikke en væsentlig forlængelsesfaktor for de intronløse humane U2 snRNA og histon H2b gener. EMBO J. 24, 4154–4165 (2005).

Hintermair, C. et al. Threonin-4 af pattedyr RNA-polymerase II CTD er målrettet af Polo-lignende kinase 3 og kræves til transkriptionel forlængelse. EMBO J. 31, 2784–2797 (2012).

Loyer, P. et al. Karakterisering af cyclin L1 og L2 interaktioner med CDK11 og splejsningsfaktorer: indflydelse af cyclin L isoformer på splejsningsstedvalg. J. Biol. Chem. 283, 7721–7732 (2008).

Cornelis, S. et al. Identifikation og karakterisering af et nyt cellecyklus-reguleret internt ribosomindgangssted. Mol. Celle 5, 597–605 (2000).

Hu, D., Valentine, M., Kidd, V. J. & Lahti, J. M. CDK11(p58) er påkrævet til opretholdelse af søsterkromatid-kohæsion. J. Cell Sci. 120, 2424–2434 (2007).

Petretti, C. et al. PITSLRE/CDK11p58 proteinkinasen fremmer centrosommodning og bipolær spindeldannelse. EMBO Rep. 7, 418–424 (2006).

Zhou, Y., Shen, J. K., Hornicek, F. J., Kan, Q. & Duan, Z. De nye roller og terapeutiske potentiale af cyclin-afhængig kinase 11 (CDK11) i human cancer. Oncotarget 7, 40846–40859 (2016).

Li, T., Inoue, A., Lahti, J. M. & Kidd, V. J. Manglende spredning og mitotisk standsning af CDK11(p110/p58)-nul mutante mus på blastocyststadiet af embryonal celleudvikling. Mol. Cell Biol. 24, 3188–3197 (2004).

Hu, D., Mayeda, A., Trembley, J. H., Lahti, J. M. & Kidd, V. J. CDK11-komplekser fremmer præ-mRNA-splejsning. J. Biol. Chem. 278, 8623–8629 (2003).

Trembley, J.H. et al. PITSLRE p110 proteinkinaser associerer med transkriptionskomplekser og påvirker deres aktivitet. J. Biol. Chem. 277, 2589–2596 (2002).

Valente, S. T., Gilmartin, G. M., Venkatarama, K., Arriagada, G. & Goff, S. P. HIV-1 mRNA 3'-endebehandling er særskilt reguleret af eIF3f, CDK11 og splejsningsfaktor 9G8. Mol. Celle 36, 279–289 (2009).

Tiedemann, R.E. et al. Identifikation af molekylære sårbarheder i humane multipelt myelomceller ved RNA-interferens dødelighedsscreening af det lægelige genom. Cancer Res. 72, 757–768 (2012).

Chi, Y. et al. Unormal ekspression af CDK11p58 i prostatacancer. Cancer Cell Int. 14, 2 (2014).

Duan, Z. et al. Systematisk kinome shRNA-screening identificerer CDK11 (PITSLRE) kinaseekspression er afgørende for osteosarkomcellevækst og -proliferation. Clin. Cancer Res. 18, 4580–4588 (2012).

Kren, B.T. et al. Præklinisk evaluering af cyclinafhængig kinase 11 og kasein kinase 2 overlevelseskinaser som RNA-interferensmål for tredobbelt negativ brystkræftbehandling. Brystkræft Res. 17, 524 (2015).

Liu, X. et al. Cyclin-afhængig kinase 11 (CDK11) er nødvendig for ovariecancercellevækst in vitro og in vivo, og dens hæmning forårsager apoptose og sensibiliserer celler over for paclitaxel. Mol. Kræft Ther. 15, 1691–1701 (2016).

Du, Y. et al. CDK11(p110) spiller en kritisk rolle i tumorigeniciteten af ​​esophageal pladecellecarcinomceller og er et potentielt lægemiddelmål. Cellecyklus 18, 452–466 (2019).

Sokolova, M. et al. Genom-wide screening af cellecyklusregulatorer i normale celler og tumorceller identificerer et differentielt respons på nukleosomudtømning. Cellecyklus 16, 189–199 (2017).

Yang, X. C., Burch, B. D., Yan, Y., Marzluff, W. F. & Dominski, Z. FLASH, et proapoptotisk protein involveret i aktivering af caspase-8, er essentielt for 3′-endebehandling af histon-præ-mRNA'er. Mol. Celle 36, 267–278 (2009).

Kohoutek, J. & Blazek, D. Cyclin K går med Cdk12 og Cdk13. Celle Div. 7, 12 (2012).

Marzluff, W.F., Wagner, E.J. & Duronio, R.J. Metabolisme og regulering af kanoniske histon-mRNA'er: liv uden en poly(A)-hale. Nat. Rev. Genet. 9, 843–854 (2008).

Zhao, J. et al. NPAT forbinder cyclin E-Cdk2 til reguleringen af ​​replikationsafhængig histon-gentransskription. Genes Dev. 14, 2283–2297 (2000).

Castello, A. et al. Indsigt i RNA-biologi fra et atlas af mRNA-bindende proteiner fra pattedyr. Celle 149, 1393–1406 (2012).

Baltz, A.G. et al. Det mRNA-bundne proteom og dets globale belægningsprofil på proteinkodende transkripter. Mol. Celle 46, 674–690 (2012).

Konig, J. et al. iCLIP afslører funktionen af ​​hnRNP-partikler i splejsning ved individuel nukleotidopløsning. Nat. Struktur. Mol. Biol. 17, 909–915 (2010).

Van Nostrand, E.L. et al. Robust transkriptomdækkende opdagelse af RNA-bindende proteinbindingssteder med forstærket CLIP (eCLIP). Nat. Metoder 13, 508–514 (2016).

Beltran, M. et al. Interaktionen af ​​PRC2 med RNA eller kromatin er gensidigt antagonistisk. Genome Res. 26, 896–907 (2016).

Trembley, JH, Hu, D., Slaughter, CA, Lahti, JM & Kidd, VJ Kaseinkinase 2 interagerer med cyclinafhængig kinase 11 (CDK11) in vivo og phosphorylerer både det RNA-polymerase II-carboxylterminale domæne og CDK11 in vitro . J. Biol. Chem. 278, 2265–2270 (2003).

Pak, V. et al. CDK11 i TREX/THOC regulerer HIV mRNA 3'-endebehandling. Celleværtsmikrobe 18, 560–570 (2015).

Peterlin, B. M. & Price, D. H. Kontrol af forlængelsesfasen af ​​transkription med P-TEFb. Mol. Celle 23, 297–305 (2006).

Bosken, C.A. et al. Strukturen og substratspecificiteten af ​​human Cdk12/Cyclin K. Nat. Commun. 5, 3505 (2014).

Lyons, S.M. et al. En undergruppe af replikationsafhængige histon-mRNA'er udtrykkes som polyadenylerede RNA'er i terminalt differentierede væv. Nucleic Acids Res. 44, 9190–9205 (2016).

Larochelle, S. et al. Cyclinafhængig kinasekontrol af initiering-til-forlængelse-omskifteren af ​​RNA-polymerase II. Nat. Struktur. Mol. Biol. 19, 1108–1115 (2012).

Gruber, J. J. et al. Ars2 fremmer korrekt replikationsafhængig histon-mRNA 3'-endedannelse. Mol. Celle 45, 87–98 (2012).

Sullivan, K. D., Mullen, T. E., Marzluff, W. F. & Wagner, E. J. Knockdown af SLBP resulterer i nuklear retention af histon-mRNA. RNA 15, 459–472 (2009).

Drogat, J. et al. Cdk11-cyclinL kontrollerer samlingen af ​​RNA-polymerase II-mediatorkomplekset. Cell Rep. 2, 1068–1076 (2012).

Kim, D. U. et al. Analyse af et genomomfattende sæt af gendeletioner i fissionsgæren Schizosaccharomyces pombe. Nat. Biotechnol. 28, 617–623 (2010).

Kurat, C.F. et al. Regulering af histon-gentransskription i gær. Cell Mol. Life Sci. 71, 599–613 (2014).

Barcaroli, D. et al. FLASH er påkrævet til histontransskription og S-faseprogression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 14808–14812 (2006).

Chapman, R.D. et al. Transskriberende RNA-polymerase II phosphoryleres ved CTD-rest serin-7. Videnskab 318, 1780–1782 (2007).

Schuller, R. et al. Heptad-specifik phosphorylering af RNA-polymerase II CTD. Mol. Celle 61, 305–314 (2016).

Lin, A. et al. Off-target toksicitet er en almindelig virkningsmekanisme for kræftlægemidler, der gennemgår kliniske forsøg. Sci. Overs. Med. 11, eaaw8412 (2019).

Rouschop, K.M. et al. Deregulering af cap-afhængig mRNA-translation øger tumorradiosensitivitet gennem reduktion af den hypoxiske fraktion. Radiother. Oncol. 99, 385–391 (2011).

Huppertz, I. et al. iCLIP: protein-RNA-interaktioner ved nukleotidopløsning. Metoder 65, 274–287 (2014).

Roberts, T.C. et al. Kvantificering af begyndende transkription ved hjælp af bromouridinimmunocapture nuklear run-on RT-qPCR. Nat. Protoc. 10, 1198–1211 (2015).

Mahat, D.B. et al. Base-par-opløsning genom-dækkende kortlægning af aktive RNA polymeraser ved hjælp af præcision nuklear run-on (PRO-seq). Nat. Protoc. 11, 1455–1476 (2016).

Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analyse af relative genekspressionsdata ved brug af real-time kvantitativ PCR og 2 –∆∆C(T) metoden. Metoder 25, 402–408 (2001).

Narita, T. et al. NELF interagerer med CBC og deltager i 3′-endebehandling af replikationsafhængige histon-mRNA'er. Mol. Celle 26, 349–365 (2007) .


Genekspression styres af en række funktioner - regulering af transkription og translation:

I eukaryoter kan transkriptions- eller målgener stimuleres eller hæmmes, når specifikke transkriptionsfaktorer bevæger sig fra cytoplasmaet ind i kernen. Da kun målgener transskriberes, betyder det, at der laves specifikke proteiner. Hver type kropscelle har forskellige målceller, så de giver forskellige karakteristika, dvs. en nervecelle er anderledes end en rød blodcelle. Transskriptionsfaktorer kan ændre transkriptionshastigheden, og processen er som følger:

  • Transskriptionsfaktorerne bevæger sig ind ved diffusion ind i kernen fra cytoplasmaet.
  • Når de er i kernen, kan de binde til promotorsekvensen (sekvensen, som er starten på målgenet).
  • Transkriptionsfaktorerne enten øger eller mindsker transkriptionshastigheden afhængigt af, om de er bundet til promotorsekvensen.

Nogle transkriptionsfaktorer kaldes aktivatorer, hvor de øger transkriptionshastigheden. Dette gøres ved, at transkriptionsfaktorerne hjælper RNA-polymerasen med at binde sig til promotorsekvensen for at aktivere transkription. Andre kaldes repressorer, hvor de nedsætter transskriptionshastigheden. Dette gøres ved, at transkriptionsfaktorerne binder til promotorsekvensen, der forhindrer RNA-polymerase i at binde. Dette stopper transskription.

Østrogen kan starte transkriptionen af ​​målgener. NB: Nogle gange kan det forårsage, at en transkriptionsfaktor er en repressor. Du behøver ikke at vide dette til AQA-eksamenen. En transkriptionsfaktor kan være bundet til en inhibitor, hvilket forhindrer den i at binde til promotorsekvensen. Østrogen binder sig til transkriptionsfaktoren, hvilket danner et østrogen-østrogenreceptorkompleks og ændrer det sted, hvor inhibitoren forbindes (kaldet DNA-bindingssted). Dette betyder, at inhibitoren løsnes, hvilket tillader transkriptionsfaktoren at binde sig til promotorsekvensen. NB: Du behøver ikke at kende navnet på inhibitoren. Også DNA-bindingsstedet på transkriptionsfaktoren forbliver ændret, mens østrogenet har bundet sig til det.

I eukaryoter og nogle prokaryoter kan translation af mRNA produceret fra målgener hæmmes af RNA-interferens kendt som RNAi. Korte RNA-molekyler såsom mikro-RNA, kendt som miRNA, og lille interferens-RNA, kendt som siRNA, danner et RNA-induceret silencing-kompleks, kendt som RISC, med proteiner. NB: De små RNA-molekyler, der vides at være dobbeltstrengede i revisionsvejledningerne eller i lærebøger, er forvirrende, så det er bedre at starte processen, da miRNA og siRNA er enkeltstrenget. RNA danner et kompleks med et protein, som er et enzym kaldet RNA-hydrolase. miRNA danner ikke et kompleks med RNA-hydrolase, men et andet protein. Disse RNA-molekyler kan hver lave en RISC med mere end ét protein, og de involverede proteiner behøver ikke at være kendt for AQA. Komplekserne binder sig hver til deres mål-mRNA-sekvens og forhindrer translation på forskellige måder. Sådan gøres det for hvert lille RNA-molekyle:

  • siRNA/miRNA i planter:
  • Baserne på siRNA'et binder til baserne på mRNA'et ved komplementær baseparring.
  • RNA-hydrolase hydrolyserer mRNA-strengen til fragmenter, hvilket forhindrer translation i at forekomme, da hele polypeptidkæden ikke vil blive lavet

NB: Det er ikke nødvendigt at vide, at fragmenterne er nedbrudt i forarbejdningslegemet. Hvis du vil lære dette, er der ingen skade.

  • miRNA hos pattedyr:
  • Baserne på miRNA'et binder til baserne på mRNA'et ved komplementær baseparring.
  • Ribosomer forhindres i at binde sig til mRNA-strengen, hvilket forhindrer translation i at forekomme.

NB: Igen her er det ikke nødvendigt at vide, at mRNA nedbrydes eller opbevares i forarbejdningslegemet.

Epigenetik involverer arvelige ændringer i genfunktion uden ændringer i DNA-basesekvensen. Disse ændringer er forårsaget af ændringer i miljøet (mere eksponering for forurening), der hæmmer transskription af:

  • Øget methylering af DNA:En methylgruppe (kendt som et epigenetisk mærke) binder til cytosin, der skal være en del af nukleotidet, der er knyttet til guanin ved hjælp af en phosphodiesterbinding. NB: Du kan være forvirret lige nu, men se på diagrammet nedenfor af en DNA-streng og læg mærke til, hvilke af cytosin-nukleotiderne methylgruppen slutter sig til. Bemærk, at nukleotidet længst til højre i strengen og det tredje fra venstre ikke har en methylgruppe, da de ikke er ved siden af ​​et nukleotid med guanin som base. Sammenføjningen af ​​methylgruppen bør ikke forveksles ved sammenføjning til cytosin, som er komplementær til guanin på den anden streng, da dette er forkert. Også methylgruppen – CH3 – ændrer ikke basesekvensen, men strukturen. Efterhånden som strukturen har ændret sig, er det blevet sværere for enzymer at binde sig til DNA'et og stoppe ekspressionen af ​​et gen. Hvis tumorsuppressorgenet ikke transskriberes, kan det forårsage kræft.

  • Nedsat antal tilknyttede histoner: En acetylgruppe – COCH3 – er et andet epigenetisk mærke, som binder til histonproteiner for at gøre kromatinet (blanding af DNA viklet omkring histonproteiner) mindre kondenseret for let genetisk ekspression. Problemet opstår, når histon-deacetylase bryder bindingen mellem histonproteinet og acetylgruppen. DNA'et bliver meget kondenseret, hvilket gør det svært for enzymer at udføre genekspressionen. NB: Histon deacetylase kan forkortes til HDAC, men det er bedst, at du bliver med det fulde navn.

Epigenetiske ændringer af DNA'et er heldigvis reversible, og derfor er de gode mål for lægemidler til at stoppe virkningerne af epigenetisk forekommende. Disse lægemidler kan enten stoppe DNA-methylering eller kan hæmme histondeacetylase, så acetylgrupperne forbliver knyttet til DNA'et.


Hvordan virker transskriptionsfaktorer?

Aktivatorer

Undertrykkere


Abstrakt

Oxideret 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin (Ox-PAPC) opregulerer et spektrum af inflammatoriske cytokiner og adhæsionsmolekyler, der er forskellige fra dem, der induceres af klassiske inflammatoriske mediatorer, såsom tumornekrosefaktor-a (TNF-α) eller lipopolysaccharid. Interessant nok inducerer Ox-PAPC også ekspressionen af ​​et sæt proteiner svarende til dem, der induceres af TNF-a eller lipopolysaccharid, som inkluderer kemokinerne monocyt kemotaktisk protein-1 (MCP-1) og interleukin (IL)-8. For at belyse de molekylære mekanismer for Ox-PAPC-induceret genekspression og for at bestemme, om Ox-PAPC og andre inflammatoriske mediatorer såsom TNF-α anvender almindelige signalveje, undersøgte vi den transkriptionelle regulering af IL-8 af Ox-PAPC og TNF- α i humane aorta-endotelceller. Både Ox-PAPC og TNF-a inducerede ekspressionen af ​​IL-8-mRNA på en dosisafhængig måde, men kinetikken af ​​IL-8-mRNA-akkumulering mellem de 2 ligander var forskellig. Ox-PAPC-induceret IL-8 mRNA blev set så tidligt som 30 minutter, toppede mellem 4 og 8 timer og faldt væsentligt med 24 timer. I modsætning hertil var TNF-a-induceret IL-8 mRNA-syntese forhøjet efter 30 minutter, toppede efter 2 timer og nåede basale/upåviselige niveauer med 6 timer. Actinomycin D-eksperimenter antydede, at både Ox-PAPC og TNF-a regulerer ekspressionen af ​​IL-8 på transkriptionsniveau. Endvidere var halveringstiden for IL-8-mRNA for begge ligander ens (<30 minutter), hvilket tyder på, at mRNA-stabilitet ikke var ansvarlig for forskellene i kinetikken af ​​IL-8-akkumulering mellem de 2 ligander. Forbigående transfektionsundersøgelser med reporterkonstruktioner indeholdende 1,48 kb af IL-8-promotoren identificerede en Ox-PAPC-specifik responsregion mellem -133 og -1481 bp af IL-8-promotoren. I modsætning hertil blev TNF-a-aktivering af IL-8-promotoren medieret næsten udelukkende gennem nuklear faktor-KB og aktiveringsprotein-1-responselementer til stede mellem -70 og -133 bp af IL-8-promotoren. Selvom Ox-PAPC og TNF-a begge inducerede IL-8-syntese, tyder vores data på, at de 2 ligander anvender forskellige mekanismer i reguleringen af ​​IL-8-transkription.

Vi har tidligere vist, at oxideret 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin (Ox-PAPC), en væsentlig bioaktiv komponent i minimalt modificeret LDL (MM-LDL), er til stede i aterosklerotiske læsioner og andre steder med kronisk inflammation. 1,2 I lighed med andre inflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), aktiverer Ox-PAPC endotelceller for at øge monocyt-endotel-interaktioner delvist gennem induktion af kemokiner, såsom monocytkemotaktisk protein-1 (MCP-1) og interleukin (IL)-8. 3,4 Interessant nok øger Ox-PAPC (eller MM-LDL) men ikke TNF-α monocyt-endotelbinding ved at mediere aktiveringen af ​​β1-integriner, hvilket resulterer i aflejring af det forbindende segment-1 domæne af fibronectin på den apikale overflade af endotelceller. 5 På den anden side øger TNF-α endotel-monocyt-interaktioner gennem induktion af E-selectin og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1, som ikke påvirkes af Ox-PAPC. 6 Ox-PAPC og TNF-α anvender således både lignende og særskilte induktionsmønstre for genekspression til at initiere endotel-monocyt-interaktioner. Selvom de molekylære mekanismer for geninduktion af TNF-α er velkendte, er målreceptorerne, signalvejene og molekylære mekanismer, hvorved Ox-PAPC (1) initierer funktionelle ændringer i endotelceller og (2) forbedrer endotel-monocyt-interaktioner, ikke kendt.

IL-8, et medlem af CXC-kemokinfamilien, blev oprindeligt karakteriseret som en neutrofil kemotaktisk og aktiverende faktor. 7,8 IL-8 blev efterfølgende identificeret til at spille en vigtig rolle i mange fysiologiske og patofysiologiske processer. 9,10 For nylig er IL-8 blevet impliceret i monocytaktivering og endotelkemotaksi under angiogenese. 11 IL-8 mRNA viste sig at være forhøjet i aterosklerotiske læsioner fra atherektomiserede humane carotisarterier såvel som i makrofagskumceller i humant atherom. 12 Ox-LDL-behandling og kolesterolbelastning inducerer IL-8 mRNA i makrofager. 13 Gerszten et al. 14 demonstrerede, at IL-8 er kritisk for den faste adhæsion af monocytter til aktiverede endotelceller. Knoglemarvstransplantation fra mus, der mangler CXC-receptor-2 (en ortolog for den humane IL-8-receptor) til mus med LDL-receptormangel resulterede i en reduktion af åreforkalkningsudvikling i modtagernes aorta. 15 Disse data tyder på, at IL-8 bidrager til udviklingen af ​​aterosklerose.

En række ligander, såsom TNF-a og lipopolysaccharid, inducerer IL-8-syntese i en række celletyper, herunder endotelceller. 16-18 IL-8-induktion af TNF-α, IL-1β, IL-6 og lipopolysaccharid reguleres på transkriptionsniveauet. 18,19 IL-8-promotoren indeholder konsensusbindingssteder for nuklear faktor-κB (NF-κB), CCAAT-enhancer-bindende protein-β (C/EBPβ) og aktiveringsprotein-1 (AP-1), alle placeret i den proksimale region mellem -70 og -133 bp af den humane IL-8-promotor. 20 I makrofager og epitelceller aktiverer TNF-α og andre inflammatoriske cytokiner IL-8-promotoren ved kooperativ binding af disse 3 transkriptionsfaktorer til et sammensat enhanceosom inden for -70 til -133 bp fra den proksimale promotor. 21-24 Ox-PAPC og MM-LDL inducerer akkumulering af IL-8-protein i humane aorta-endotelcelle (HAEC)-supernatanter 3, men mekanismerne for Ox-PAPC-induceret IL-8-syntese er ikke kendte. I et forsøg på at bestemme de molekylære mekanismer, hvorved Ox-PAPC inducerer IL-8-genekspression, undersøgte vi reguleringen af ​​IL-8 ved Ox-PAPC og TNF-α i HAEC'er.

Metoder

Reagenser

Vævskulturmedier og reagenser blev opnået fra Irvine Scientific Inc. Føtalt bovint serum (FBS) blev opnået fra Hyclone. PAPC blev købt fra Sigma, og Ox-PAPC blev fremstillet som beskrevet tidligere. 2 Oxidation blev overvåget ved massespektrometri og afsluttet, når >90% af PAPC var oxideret. Under disse betingelser blev der observeret minimal dannelse af lysophosphatidylcholin. Massespektrometriprofilerne for Ox-PAPC anvendt i de foreliggende undersøgelser svarede således til dem, der tidligere er vist. 2 Endotoksinkoncentrationer i phospholipidopløsningerne var <0,1 pg/ml. TNF-a blev købt fra R&D. AP-1 (5'-CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC-3'), NF-κB (5'-GATCCAGGGGACTTTCCCTAGC-3') og Oct-1 (5'-TGTCGAATGCAAATCACTAGA-3') oligonukleotider var køb fra Santa-mobilitetsskifte-elektroforayet. Cruz bioteknologi. Radioisotoper blev købt fra Amersham Pharmacia Biotech. Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM)/højglukosemedium til HeLa-cellekultur og M199-medium til HAEC-kultur blev købt fra Gibco/BRL.

Cellekultur

HAEC'er blev isoleret fra aortaringene af eksplanterede donorhjerter som beskrevet tidligere 1 og dyrket i M199 medium suppleret med 20% (vol/vol) FBS, penicillin-streptomycin (100 U/mL og 100 μg/mL, henholdsvis Gibco/BRL) , natriumpyruvat (1 mmol/L), heparin (90 μg/mL, Sigma) og endotelcellevækstfaktor (20 μg/mL, Fisher Scientific). HeLa-celler (American Type Culture Collection, Manassas, Va) blev dyrket i DMEM/høj-glucose-medium med 10% (vol/vol) FBS og penicillin-streptomycin.

Plasmider og sted-dirigeret mutagenese

Konstruktion af luciferasereporterplasmider med en længere human IL-8-promotor (-1481 til +44 bp), en kortere IL-8-promotor (-133 til +44 bp) og flere kopier af individuelle NF-κB, C/EBPβ, eller AP-1 elementer er blevet beskrevet tidligere. 25 Mutationer i NF-KB- og AP-1-elementerne i sammenhæng med luciferase-reporterkonstruktionen indeholdende den længere IL-8-promotor fra -1481 til +44 bp (p[-1481/+44]-Luc) blev skabt med en kommercielt tilgængelige site-directed mutagenese kit (QuickChange, Stratagene) og protokoller leveret af producenten. Mutationsprimere af de 3 elementer blev designet som tidligere beskrevet 26,27 og tilpasset fra Invitrogen. NF-KB-elementet blev muteret fra TGAATTTCCT til TGGAATTTaaa og AP-1-elementet, fra TGACTCA til TGACTgt.

Forbigående Transfektion

HeLa-celler blev udpladet i 6-brønds kulturskåle (2x105 celler pr. brønd) i DMEM/højglukosemedium indeholdende 10% FBS. Alle transfektioner blev udført med i alt 1 μg pr. brønd DNA med Superfect Reagent (8 μL pr. brønd, Qiagen) i henhold til producentens protokol. Fire timer efter transfektion blev celler stimuleret med enten Ox-PAPC eller TNF-a i DMEM/højglukosemedium/1 % FBS. Efter 12 timer blev totale cellelysater opsamlet og analyseret for luciferaseaktivitet ved anvendelse af et luciferaseassaysystemkit (Promega). Luciferaseaktivitet blev normaliseret til den for cotransficeret pSV-p-galactosidase (Promega).

Enzym-Linked Immunosorbent Assay

IL-8-niveauer i HAEC-supernatanter blev målt med et IL-8 ELISA-kit (Quantikine, R&D) i henhold til producentens protokol.

Northern Blotting

Totalt cellulært RNA blev isoleret fra HAEC'er og HeLa-celler ved at bruge Trizol-reagenser (Gibco/BRL) i henhold til producentens protokol. Den humane IL-8 cDNA-probe (en 1,2-kb ØkoRI-fragment af humant IL-8 cDNA) blev radiomærket med [a-32P]dCTP ved den tilfældige primingmetode. En glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase probe blev inkluderet til normalisering, og kvantitative analyser blev udført i alle forsøg med en phosphoimager (Kodak).

Ekstraktion af nukleare proteiner og elektroforetisk mobilitetsforskydningsanalyse

HeLa-celler blev præinkuberet med 1 % FBS-holdigt DMEM/højglukosemedium i 1 dag. Celler blev behandlet i 30 minutter med Ox-PAPC, TNF-a og phorbol 12-myristat 13-acetat (Sigma). Celler blev derefter høstet og resuspenderet i 50 μL cellelysebuffer (10 mmol/L HEPES pH 7,9, 10 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L MgCl20,5 mmol/L dithiothreitol [DTT] og 0,1 % NP-40) og inkuberet på is i 10 minutter. Cellelysaterne blev blandet kort og centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 minutter ved 4°C. Derefter blev pellets resuspenderet i 15 μL kernelysebuffer (20 mmol/L HEPES pH 7,9, 1,5 mmol/L MgCl25 mmol/L DTT, 0,5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L PMSF, 25% glycerol og 0,42 mol/L NaCI) og inkuberet på is i 15 minutter. De nukleare lysater blev blandet kort og centrifugeret ved 14.000 rpm i 15 minutter ved 4°C. Supernatanterne blev opsamlet og opbevaret ved -80 °C til fremtidige elektroforetiske mobilitetsskift-assayundersøgelser. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden.

Den elektroforetiske mobilitetsskiftanalyse blev udført som tidligere beskrevet. 28 Kort fortalt blev oligonukleotider endemærket med [γ-32P]ATP ved at bruge T4 polynukleotidkinase og oprenset i Microspin-søjler (Bio-Rad). For hver 10-μL reaktion blev 8 μg nukleært ekstraktprotein og 1 μL oprensede mærkede oligonukleotider inkuberet med 1 μL dI-dC (1 μg/μL) og 1 μL 10x bindingsbuffer (10 mmol/L Tris- HCl pH 7,5, 50 mmol/L NaCl, 0,5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L MgCl20,5 mmol/L DTT og 4 % glycerol) ved stuetemperatur i 20 minutter. Prøver blev underkastet elektroforese på en 4% ikke-denatureret polyacrylamidgel i 0,5 x Tris-borat-EDTA-buffer ved 100 V i 1 time. Gelerne blev tørret og udsat for en 32P phosphoimager i 2 timer til natten over, afhængigt af intensiteten af ​​radioaktiviteten på de tørrede geler.

Resultater

Ox-PAPC-induceret IL-8-mRNA og proteinsyntese i HAEC'er

Vi har tidligere vist, at Ox-PAPC inducerer akkumulering af IL-8-protein i HAEC-supernatanter. 3 For at bestemme, om Ox-PAPC-induceret akkumulering af IL-8-protein var et resultat af ny IL-8 mRNA-syntese, udførte vi Northern blotting-analyse på HAEC'er behandlet med forskellige koncentrationer af Ox-PAPC og PAPC. Ox-PAPC inducerede IL-8 mRNA-syntese på en dosisafhængig måde (figur 1A). Ubehandlede og PAPC-behandlede (op til 100 μg/ml) HAEC'er havde meget minimal, hvis nogen, IL-8-meddelelse (figur 1A). Ox-PAPC inducerede også IL-8-proteinakkumulering i HAEC-supernatanter på en dosisafhængig måde (figur 1B).

Figur 1. Ox-PAPC inducerer IL-8 besked og protein. HAEC'er blev behandlet med forskellige koncentrationer af Ox-PAPC (0 til 100 μg/mL) og PAPC (0 til 100 μg/mL). Fire timer senere blev totalt RNA og supernatant opsamlet for at bestemme niveauerne af Ox-PAPC-induceret IL-8 mRNA (A) og protein (B). Resultaterne er repræsentative for 4 separate eksperimenter. Fejlbjælker blev bestemt statistisk med triplikater af samme tilstand i 1 eksperiment.

Kinetikken af ​​IL-8 mRNA-akkumulation er forskellig i Ox-PAPC-behandlede og TNF-α-behandlede HAEC'er

Vi undersøgte derefter tidsforløbet for TNF-α-induceret og Ox-PAPC-induceret IL-8-meddelelsesophobning i HAEC'er. Ox-PAPC-inducerede IL-8-transkripter blev set så tidligt som 30 minutter (3 gange stigning), toppede mellem 4 og 8 timer (≈ 60 gange stigning) og faldt signifikant med 24 timer (8 gange stigning figur 2A) og 2B). I modsætning hertil var TNF-a-inducerede IL-8-mRNA-niveauer maksimale efter 2 timer (300 gange induktion), men vendte tilbage til basislinjen efter 6 timer (figur 2A og 2B). I nærvær af cycloheximid blev IL-8 mRNA stadig forøget 65 gange, hvilket tyder på, at ny proteinsyntese ikke spiller en rolle i denne forlængede induktion af Ox-PAPC. IL-8-protein blev påvist i Ox-PAPC-behandlede HAEC-supernatanter så tidligt som 2 timer, og niveauerne var stadig stigende efter 24 timer (figur 2C). TNF-a-induceret IL-8-protein akkumulerede så tidligt som 1 time og toppede mellem 8 og 12 timer. Der var ingen signifikant forskel i niveauet af IL-8 efter 12 timer (figur 2D). Disse data tyder på, at IL-8-proteinakkumulering er parallel med IL-8-mRNA-induktion af de 2 midler.

Figur 2. Ox-PAPC og TNF-α inducerer IL-8 mRNA og protein, men med forskellig kinetik. HAEC'er blev behandlet med enten Ox-PAPC (50 μg/mL) eller TNF-α (2 ng/mL). Totalt RNA og medium blev opsamlet med forskellige tidsintervaller (0 til 24 timer). A, Northern blots blev udført med 5 μg total RNA ekstraheret fra Ox-PAPC- (øverste panel) eller TNF-α- (nederste panel) behandlede HAEC'er. B, Phosphoimage-analyse af Northern blots af IL-8 mRNA induceret af Ox-PAPC og TNF-α. Alle IL-8-meddelelsesniveauer blev normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenaseniveauer. C og D, ELISA'er blev udført på HAEC-supernatanter for at bestemme niveauerne af IL-8-proteinsyntese induceret af Ox-PAPC (C) og TNF-a (D) ved forskellige tidsintervaller (0 til 24 timer). Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter.

Ox-PAPC øget IL-8 mRNA-akkumulation ved at øge transkriptionen

For at bestemme, om IL-8-mRNA-akkumulering sker på transkriptionsniveauet, blev HAEC'er forbehandlet med actinomycin D (400 nmol/L) i 30 minutter og derefter behandlet med enten Ox-PAPC (50 μg/mL) eller TNF-α (20) ng/ml) i 2 timer. Northern blot-analyse (figur 3A) viste, at actinomycin D fuldstændigt inhiberede IL-8-transkription af både Ox-PAPC og TNF-a (henholdsvis 87 % og 91 % reduktion, figur 3B). For at bestemme, om forskellene i posttranskriptionel regulering af IL-8 stod for forskellene i kinetikken af ​​IL-8-induktion af Ox-PAPC og TNF-α, blev HAEC'er behandlet med enten Ox-PAPC eller TNF-α i 2 timer før actinomycin D (400 nmol/L) behandling, og IL-8 mRNA blev kvantificeret på forskellige tidspunkter. IL-8 mRNA-transkriptet blev fuldstændigt nedbrudt med 1 time for både TNF-a og Ox-PAPC (figur 3B), hvilket indikerer, at halveringstiden for IL-8 mRNA for begge var ens (<30 minutter). These data suggest that both Ox-PAPC-induced and TNF-α-induced IL-8 expression is regulated at the level of transcription in HAECs (Figure 3C).

Figur 3. Ox-PAPC and TNF-α regulate IL-8 message at the level of transcription. HAECs were treated with or without actinomycin D (400 nmol/L) for 30 minutes and then with Ox-PAPC (40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL). Two hours later, total RNA were extracted and IL-8 message induced by TNF-α and Ox-PAPC was determined by Northern blot (A) and quantified by phosphoimage analysis (B). All IL-8 message levels were normalized to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase levels. The stability of induced IL-8 mRNA by both ligands was determined by measuring the message half-life. HAECs were first treated with either Ox-PAPC or TNF-α. Two hours later, actinomycin D (400 nmol/L) was added to inhibit any further synthesis of new message. Total RNA was extracted at different time intervals (0, 1, 2, and 4 hours) after addition of actinomycin D. Northern blots and phosphoimager analysis were performed to quantify the levels of IL-8 mRNA (expressed as the percentage of IL-8 message amount at 0 hours) induced by Ox-PAPC (solid line) or TNF-α (dashed line). Results are representative of 2 separate experiments.

Ox-PAPC and TNF-α Activated Reporter Constructs Containing a 1.48-kb IL-8 Promoter

Both Ox-PAPC and TNF-α induced IL-8 protein synthesis in HeLa cells (data not shown) therefore, IL-8 promoter regulation study was performed in this easily transfected cell type. To determine whether Ox-PAPC can induce transcriptional activation of the human IL-8 promoter, HeLa cells were transiently transfected with a luciferase reporter plasmid containing −1481 to +44 bp of the human IL-8 promoter and were then treated with various concentrations of Ox-PAPC. Ox-PAPC induced luciferase activity in a dose-dependent fashion, suggesting that Ox-PAPC response elements are present in the first 1.48 kb of the IL-8 promoter (Figure 4).

Figur 4. Ox-PAPC and TNF-α activate luciferase reporter constructs containing the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected for 2 hours with 0.8 μg per well of p(−1481/+44)-Luc, together with 0.2 μg per well of β-galactosidase expression plasmid, as described in Methods. Transfected cells were treated with various concentrations of Ox-PAPC (from 25 to 40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL) for 12 hours. Cell lysates were collected and assayed for luciferase and β-galactosidase activities. Luciferase activities were expressed in arbitrary units after being normalized against β-galactosidase activities. Results are representative of 3 separate experiments.

Studies on NF-κB, AP-1, and Oct-1 Activation

To determine whether NF-κB, C/EBPβ, or AP-1 response elements participate in Ox-PAPC-mediated transcriptional activation, reporter constructs containing multiple NF-κB (p[NF-κB]3-Luc), C/EBPβ (p[C/EBPβ]3-Luc), or AP-1 (p[AP-1]3-Luc) elements were transiently transfected into HeLa cells. TNF-α strongly activated p[NF-κB]3-Luc by 7-fold, whereas Ox-PAPC had no effect (Figure 5A). On the other hand, Ox-PAPC mildly activated the p[AP-1]3-Luc construct (Figure 5B), whereas TNF-α had no effect. Plasmid p[C/EBPβ]3-Luc was not activated by either TNF-α or Ox-PAPC (data not shown). Furthermore, nuclear extracts from cells treated with TNF-α but not Ox-PAPC showed increased binding activity to a [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB consensus sequence from the human IL-8 promoter (Figure 5C). TNF-α did not affect AP-1 binding activity in HeLa nuclear extracts, whereas a minimal increase was seen with Ox-PAPC (Figure 5C). Phorbol 12-myristate 13-acetate, an AP-1 activator, served as a positive control. Previous studies had shown that the induction of IL-8 may be the result of downregulation of Oct-1, a constitutive repressor of the C/EBPβ response element. 29 Because Ox-PAPC did not induce NF-κB and only minimally induced AP-1 activity, we hypothesized that Oct-1 binding activity might be decreased by Ox-PAPC and result in induction of IL-8. However, nuclear extracts from HeLa cells treated with Ox-PAPC or TNF-α showed no decrease in Oct-1 binding activity on the electrophoretic mobility shift assay (Figure 5C).

Figur 5. Activation of NF-κB, AP-1, and Oct-1. HeLa cells were transiently transfected with 0.8 μg of (A) p[NF-κB]3-Luc or (B) p[AP-1]3-Luc as per the aforementioned protocol in the legend to Figure 4. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (solid black bar) or 2 ng/mL TNF-α (dotted bar) for 12 hours. Results were shown in luciferase activity units that were normalized against β-galactosidase activities. p[NF-κB]3-Luc is a luciferase reporter construct with 3 copies of the NF-κB responsive element and p[AP-1]3-Luc, with 3 copies of the AP-1 responsive element. C, HeLa cell nuclear extracts were harvested after 30 minutes of stimulation with Ox-PAPC (40 μg/mL), TNF-α (2 ng/mL), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/mL), or control media (C). [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB, AP-1, and Oct-1 oligonucleotides were individually incubated with 5 μg of nuclear extracts at room temperature for 20 minutes. Reaction products were run on nondenatured gels and exposed to phosphoimage analysis. These image values were used to calculate the fold induction (above lanes) compared with untreated cells, and all values obtained were well within the linear range of phosphoimage measurement. Results are representative of 2 separate experiments.

An Ox-PAPC-Responsive Element Is Located in the Upstream Region of the Human IL-8 Promoter

To determine the sequences in the IL-8 promoter important for Ox-PAPC-induced transcription, reporter constructs containing different lengths of the IL-8 promoter (−1481 to +44 and −133 to +44) were transiently transfected into HeLa cells. The IL-8 promoter construct containing p[−1481/+44]-Luc was activated by Ox-PAPC however, the construct containing p[-133/+44]-Luc was only mildly activated by Ox-PAPC (Figure 6B). In contrast, TNF-α activated both the longer p[−1481/+44]-Luc and the shorter p[−133/+44]-Luc constructs (>17-fold, Figure 6A). Thus, deletion of the upstream region of the IL-8 promoter from −1481 to −133 bp resulted in a 75% reduction in promoter activation by Ox-PAPC (Figures 6A and 6B), suggesting that an Ox-PAPC-response region resides between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. Individual mutations in the conserved response elements (NF-κB and AP-1) generated in the context of the longer construct p[−1481/+44]-Luc] resulted in significant inhibition of TNF-α-induced IL-8 promoter activation but only slightly decreased Ox-PAPC-induced activation (Figures 6A and 6B).

Figur 6. Ox-PAPC mediates IL-8 promoter activation through an Ox-PAPC-specific response region between −133 and −1481 bp of the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected with 2 luciferase reporter plasmids, p[−1481/+44]-Luc and p[−133/+44]-Luc, or with 3 separate p[−1481/+44]-Luc constructs containing site-directed mutations of the NF-κB or AP-1 element, as described in Methods. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (A) or 1 ng/mL TNF-α (B). Results are shown as the fold induction above control. P-1481 indicates p[−1481/+44]-Luc P-133, p[−133/+44]-Luc. Results are representative of 3 separate experiments.

Diskussion

This study is the first to examine the mechanism by which Ox-PAPC, an oxidatively fragmented lipid component of MM-LDL, regulates transcription. In this study, Ox-PAPC was compared with the more thoroughly characterized regulation of IL-8 by TNF-α. Our results demonstrate that the major effect of Ox-PAPC on the IL-8 promoter is involved with an upstream sequence between −1481 and −133 bp. There are several responsive elements present in this region of the human IL-8 promoter that have been known for years, eg, the glucocorticoid responsive element and the hepatocyte nutrition factor-1 binding site, which are located at positions −330 to −325 bp and −381 to −376 bp, respectively, upstream from the TATA box. 20 Neither has been demonstrated to have a transcription-enhancing property in fact, activated glucocorticoid responsive element mediates the downregulation of NF-κB-activated transcription by interfering with the binding of NF-κB p65 to its cis-element 30 or by directly interfering with transactivation of the NF-κB p65 subunit. 31 There is no other cis-element in the human IL-8 promoter that has been described. Thus, we propose that there is a novel cis-element located in the 5′-flanking region between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. One likely candidate for this putative distant enhancer may be the peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE).

Recently, work from our laboratory has shown that MM-LDL and Ox-PAPC activate PPRE and peroxisome proliferator-activated receptor-α activators and stimulate the production of MCP-1 and IL-8 in HAECs. 3 Additionally, the PPRE has been reported to function as an indispensable cis-enhancing element that may be located as far as −2 kb upstream from the transcription initiation site. 32 These observations support the notion that the PPRE may be the cis-enhancing element responsive to Ox-PAPC in the 5′-flanking sequence of the human IL-8 promoter.

In our current study, by using both gel shift assays and transient transfection experiments, neither the NF-κB nor AP-1 signaling pathway was activated by Ox-PAPC. This result is different from previous data showing activation of NF-κB and AP-1 signaling by Ox-LDL, 33–35 MM-LDL, 36 or oxidized phospholipids, such as platelet-activating factor-like lipids. 37 Activation of NF-κB by Ox-LDL was demonstrated to be a result of enhanced phosphorylation of inhibitor-κB in monocytes. 34 Platelet-activating factor-like lipids, enzymatically oxidative fragmentation products of ether-containing phosphatidylcholine, activate NF-κB signaling in the cells expressing platelet-activating factor receptors, such as monocytes. 37 MM-LDL was also shown by electrophoretic mobility shift assay to activate binding to an NF-κB consensus sequence. 36 Although Ox-PAPC activates the AP-1 element in isolation, it only minimally increased AP-1 binding on the electrophoretic mobility shift assay and activated the longer IL-8 promoter with the AP-1 mutation. Thus, we have demonstrated that unlike Ox-LDL, the AP-1 element is not important in the human IL-8 promoter activation by Ox-PAPC.

The difference in the effects of Ox-LDL, MM-LDL, platelet-activating factor-like lipids, and Ox-PAPC may be related to the different cell types used for these studies. Furthermore, they may be related to the different bioactive lipid components in Ox-PAPC versus Ox-LDL and platelet-activating factor-like lipids. We found that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine, an oxidative fragmented product purified from Ox-PAPC, is the major bioactive lipid that enhances monocyte binding to endothelial cells. 38 The level of this phospholipid is quite low in Ox-LDL furthermore, Ox-PAPC, being ester derived, does not contain platelet-activating factor-like lipids. In a separate study, it will be shown that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine and its dehydration product are the lipids in Ox-PAPC that are mainly responsible for inducing IL-8 in HAECs.

In summary, this current study has provided information on the mechanism by which Ox-PAPC induces IL-8 transcription. We have demonstrated that Ox-PAPC transcriptionally regulates IL-8 and causes a prolonged increase in transcription, compared with TNF-α. This prolonged increase was not secondary to new protein synthesis. We have also shown that the induction of IL-8 by Ox-PAPC, unlike that by Ox-LDL or TNF-α, is not mediated by way of the NF-κB signaling pathway. IL-8 upregulation by Ox-PAPC is also not a result of activation of NF-κB, C/EBPβ, and AP-1 or of downregulation of a constitutive transcriptional repressor Oct-1. Rather, we have demonstrated that Ox-PAPC induces IL-8 expression by activation of a putative cis-enhancer element in the upstream IL-8 promoter sequence. Our results showing differential regulation of the IL-8 promoter by Ox-PAPC compared with that by TNF-α provide a basis for the differences previously reported in genes activated by the 2 agents.

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grant HL30568 and NIH training grant 5T32HL07895.

Received July 16, 2001 revision accepted July 27, 2001.

We thank Dr Yin Tintut for her technical support in several key experiments in this work.


Transcription: from DNA to mRNA

Both prokaryotes and eukaryotes perform fundamentally the same process of transcription, with the important difference of the membrane-bound nucleus in eukaryotes. With the genes bound in the nucleus, transcription occurs in the nucleus of the cell and the mRNA transcript must be transported to the cytoplasm. The prokaryotes, which include bacteria and archaea, lack membrane-bound nuclei and other organelles, and transcription occurs in the cytoplasm of the cell. In both prokaryotes and eukaryotes, transcription occurs in three main stages: initiation, elongation, and termination.

Initiation

Transcription requires the DNA double helix to partially unwind in the region of mRNA synthesis. The region of unwinding is called a transcription bubble . The DNA sequence onto which the proteins and enzymes involved in transcription bind to initiate the process is called a promoter . I de fleste tilfælde eksisterer promotorer opstrøms for de gener, de regulerer. The specific sequence of a promoter is very important because it determines whether the corresponding gene is transcribed all of the time, some of the time, or hardly at all (Figure 2).

Figur 2: The initiation of transcription begins when DNA is unwound, forming a transcription bubble. Enzymes and other proteins involved in transcription bind at the promoter.

Forlængelse

Transcription always proceeds from one of the two DNA strands, which is called the template strand . The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand , with the exception that RNA contains a uracil (U) in place of the thymine (T) found in DNA. During elongation, an enzyme called RNA polymerase proceeds along the DNA template adding nucleotides by base pairing with the DNA template in a manner similar to DNA replication, with the difference that an RNA strand is being synthesized that does not remain bound to the DNA template. As elongation proceeds, the DNA is continuously unwound ahead of the core enzyme and rewound behind it (Figure 3).

Figur 3: During elongation, RNA polymerase tracks along the DNA template, synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction, and unwinds then rewinds the DNA as it is read.

Afslutning

Når et gen er transskriberet, skal den prokaryote polymerase instrueres i at dissociere fra DNA-skabelonen og frigøre det nyfremstillede mRNA. Depending on the gene being transcribed, there are two kinds of termination signals, but both involve repeated nucleotide sequences in the DNA template that result in RNA polymerase stalling, leaving the DNA template, and freeing the mRNA transcript.

On termination, the process of transcription is complete. In a prokaryotic cell, by the time termination occurs, the transcript would already have been used to partially synthesize numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently using multiple ribosomes (polyribosomes) (Figure 4). I modsætning hertil udelukker tilstedeværelsen af ​​en kerne i eukaryote celler samtidig transkription og translation.

Figur 4: Flere polymeraser kan transskribere et enkelt bakterielt gen, mens adskillige ribosomer samtidig oversætter mRNA-transkripterne til polypeptider. På denne måde kan et specifikt protein hurtigt nå en høj koncentration i bakteriecellen.


Hvad er forholdet mellem transskription og oversættelse?

Transskription er processen med at lave en RNA-kopi af en gensekvens. Oversættelse er processen med at oversætte sekvensen af ​​et messenger-RNA-molekyle til en sekvens af aminosyrer under proteinsyntese. Så forholdet mellem de to processer er, at de begge er involveret i proteinsyntese, og at transkription er først, derefter translation er anden. I sidste ende er dette alt, hvad vi ved om transkription og oversættelse med hensyn til genetik. Læs videre, hvis du vil forstå mere om transskription og oversættelse når vi taler om tjenester.

Uanset om det er en offentlig tale, interview, markedsundersøgelse eller finansiel rapport, hvis du håber, at dit budskab når ud til et så bredt publikum som muligt, bør du overveje at transskribere og derefter oversætte det til dine målsprog. Så, her går vi!

Transskriptionen

Ligesom i genetik er transskription nødvendig for at ske først. Det er ifølge Merriam Webster handlingen at lave en skrevet, trykt eller maskinskrevet kopi af ord, der er blevet talt. At have et dokumenteret tekstformat af dine lyd- og videofiler er helt nødvendigt for for eksempel virksomheder. Det er en pragmatisk måde at holde styr på og bedre forstå, hvad der bliver sagt. Hvis du kunne lide ideen, så planlæg omhyggeligt, da det tager meget tid for alle, der er uerfarne i transskription, at omdanne en lydoptagelse til et klart tekstdokument. Tip: overlad denne trættende og kedelige opgave til vores professionelle transkriptionister, som garanterer fortrolighed, nøjagtighed og den højeste kvalitet.

Oversættelsen

Når du har en klar og korrekturlæst udskrift, kan du gå videre med oversættelsen. Det er dybest set handlingen at ændre et sprog til et andet. Men i praksis er det ikke blot at ændre ord til deres ækvivalenter på forskellige sprog. Kvalitetsoversættelse involverer at kende konteksten og den kulturelle baggrund, som ordene i den originale tekst stammer fra, og derefter vælge ord og vendinger på det nye sprog, som bedst formidler originalens substans og betydning i en ny og anderledes kulturel kontekst. Medmindre alt dette sker, kan meddelelsen blive misfortolket eller endda gået tabt. Desuden, hvis du vil investere ressourcer til denne tjeneste, skal du sørge for at søge efter den bedste timing, enkelhed og publikumstilpasning.


Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor.

Glucose represses the transcription of many genes in bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae). Mig1 is a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex Ssn6-Tup1. We have found that the subcellular localization of Mig1 is regulated by glucose. Mig1 is imported into the nucleus within minutes after the addition of glucose and is just as rapidly transported back to the cytoplasm when glucose is removed. This regulated nuclear localization requires components of the glucose repression signal transduction pathway. An internal region of the protein separate from the DNA binding and repression domains is necessary and sufficient for glucose-regulated nuclear import and export. Changes in the phosphorylation status of Mig1 are coincident with the changes in its localization, suggesting a possible regulatory role for phosphorylation. Our results suggest that a glucose-regulated nuclear import and/or export mechanism controls the activity of Mig1.


Se videoen: Biology: Cell Structure I Nucleus Medical Media (August 2022).