Information

12.2H: Fluorescerende antistoffer - Biologi

12.2H: Fluorescerende antistoffer - Biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Fluorescerende antistoffer er antistoffer, der er blevet mærket med en fluorescerende forbindelse for at lette deres påvisning i laboratoriet.

Læringsmål

  • Beskriv hvordan fluorescerende antistofkonjugater kan bruges i immunoassays til proteinpåvisning

Centrale punkter

  • Fluorescerende mærkning af antistoffer bruges i stedet for radioisotoper og enzymer for at øge følsomheden og specificiteten af ​​immunologiske tests.
  • Fluorescerende antistoffer kan bruges til at farve proteiner fra patientserum eller vævssnit fikseret på et objektglas eller levende celler i suspension.
  • Fluorescerende antistoffer kan påvises med et fluorescerende mikroskop eller en flowcellesorteringsmaskine.

Nøglebegreber

  • radioisotop: En radioaktiv isotop af et grundstof.

Fluorescerende mærkning er en anden metode til at demonstrere kompleksiteten af ​​antigener og antistoffer. Fluorescerende molekyler bruges som erstatninger for radioisotop- eller enzymmærker. Fluorescerende antistofteknikken består i at mærke antistof med farvestoffer såsom fluorescein isothiocyanat (FITC). Disse forbindelser har høj affinitet for proteiner, som de konjugerer med.

Fluorescerende teknikker er meget specifikke og følsomme, så fluorescerende antistof-baserede teknikker kræver et fluorescerende mikroskop. Et fluorescerende stof absorberer lys med en bølgelængde og udsender lys med en længere bølgelængde. Fluorescein fluorescerer en intens æblegrøn farve, når det exciteres under fluorescerende mikroskopi. Den kemiske manipulation ved mærkning af antistoffer med fluorescerende farvestoffer for at tillade påvisning ved direkte mikroskopiundersøgelse forringer ikke antistofaktivitet.

Efter mærkning af et specifikt antistof med et fluorescerende molekyle kan det stadig reageres med dets antigen og identificeres mikroskopisk. Fluorescerende antistofkonjugater er almindeligt anvendt i immunoassays. De grundlæggende metoder, der anvender fluorescerende antistoffer, indbefatter direkte, inhibering og indirekte immunfluorescerende assay.

I den direkte teknik bruges et fluorescerende antistof til at detektere antigen-antistof-reaktioner på et mikroskopisk niveau. Inhiberingsimmunfluorescerende assay er en blokeringstest, hvor et antigen først udsættes for et umærket antistof, derefter for et fluorescerende antistof og til sidst vaskes og undersøges. Indirekte immunfluorescensassay er baseret på antistoffers evne til at reagere med antigener samt fungere som antigener og reagere med anti-antistof (anti-immunoglobulin). Denne teknik bruges i vid udstrækning til påvisning af autoantistoffer og antistoffer mod væv og cellulære antigener. De beskrevne metoder udføres for det meste på objektglas med patientserum eller vævssnit. Immunfluorescens kan også udføres for at identificere specifikke antigener på levende celler i suspension. Denne metode er kendt som flowcytometri og kræver en flowcellesorteringsmaskine frem for et fluorescerende mikroskop.


Tips til optimering af immunfluorescensprotokoller for at få det bedste billede

Anvendelser til immunfluorescens (IF) - hvor et antistof er konjugeret til et molekyle, der fluorescerer, når det exciteres af lasere - omfatter proteinlokalisering, bekræftelse af post-translationel modifikation eller aktivering og nærhed til/kompleksdannelse med andre proteiner. Immunocytokemi (ICC) er en veletableret teknik, der bruger antistoffer til at binde sig til mål i celleprøver og Coons et al første gang beskrev immundetektering ved hjælp af et fluorescerende reportermolekyle i 1942. Ud over at give information om subcellulære mål, giver kombinationen af ​​immunfluorescens med immuncytokemi nogle af de mest overbevisende visuelle data inden for biovidenskaberne. I denne guide deler antistofforskere, hvad vi har lært om at få det bedst mulige billede fra dine IF-ICC-eksperimenter.

Figur 1. Immuncytokemi (ICC) lokaliserer proteiner forbundet med neuronale kerner, soma og axoner (til venstre). Til højre, immunfluorescerende farvning af human cellelinje U-251 MG.


Enzymtranslokationer under glat muskelaktivering

Raouf A. Khalil, Kathleen G. Morgan, i Biochemistry of Smooth Muscle Contraction, 1996

1 Fluorescensmikroskopi i levende celler

Fluorescensmikroskopi gør det muligt at studere den subcellulære fordeling af enzymer i intakte celler. Relativt få prober er tilgængelige til direkte at overvåge fordelingen af ​​kinaser i levende celler. Et eksempel er det fluorescerende phorbolesterderivat Bodipy phorbol, som er blevet brugt til at spore PKC-fordelinger i levende celler (Khalil og Morgan, 1991). Denne forbindelse er membrangennemtrængende, men har den ulempe, at den bibeholder PKC-agonistaktivitet. En gruppe af forbindelser, der udviser den modsatte ulempe, det vil sige fastholdelse af PKC-antagonistaktivitet, er blevet tilgængelig (Chen og Poenie, 1993). Brugen af ​​en ratiometrisk indikator til at overvåge cAMP-afhængig proteinkinasefordeling og aktivitet i levende celler er blevet beskrevet (Bacskai et al, 1993), men på nuværende tidspunkt er dets anvendelse i glat muskulatur ikke blevet rapporteret. En anden relateret tilgang er at introducere mærkede antistoffer i permeabiliserede fysiologisk intakte celler (Iizuka et al, 1994). Vanskeligheden ved denne fremgangsmåde er problemet med, hvorvidt ikke-specifikke bindingssteder kan "blokeres" i den intakte celle.


INSTRUMENTATION

Traditionelle flowcytometre

Traditionelle flowcytometre består af tre systemer: fluidik, optik og elektronik. Fluidiksystemet består af kappevæske (normalt en bufret saltvandsopløsning), der er sat under tryk for at levere og fokusere prøven til laseropfangnings- eller interrogationspunktet, hvor prøven analyseres. Det optiske system består af excitationsoptik (lasere) og opsamlingsoptik (fotomultiplikatorrør eller PMT'er og fotodioder), der genererer de synlige og fluorescerende lyssignaler, der bruges til at analysere prøven. En række dikroiske filtre styrer det fluorescerende lys til specifikke detektorer og båndpasfiltre bestemmer bølgelængderne af lys, der aflæses, så hver enkelt fluorokrom kan detekteres og måles. Mere specifikt er dikroiske filtre filtre, der passerer lys igennem, der enten er kortere eller længere i bølgelængde og reflekterer det resterende lys i en vinkel. For eksempel lader et 450 Dichroic Long Pass-filter (DLP) lys, der har en længere bølgelængde end 450 nm, gennem filteret og hopper de kortere bølgelængder af lys af i en vinkel for at blive sendt til en anden detektor. Båndpasfiltre registrerer et lille vindue med en bestemt bølgelængde af lys. For eksempel passerer et 450/50 båndpasfilter fluorescerende lys, der har en bølgelængde på 450 nm +/− 25 nm gennem filteret for at blive aflæst af detektoren. Det elektroniske system konverterer signalerne fra detektorerne til digitale signaler, der kan læses af en computer.

Flere lasersystemer er almindelige med instrumenter, der ofte har 20 parametre (FSC, SSC og 18 fluorescerende detektorer). Der introduceres nye instrumentplatforme med fem eller flere lasere og 30� parametre, men disse er mindre almindelige. De mest almindelige lasere, der bruges i traditionelle flowcytometre, er 488 nm (blå), 405 nm (violet), 532 nm (grøn), 552 nm (grøn), 561 nm (grøn-gul), 640 nm (rød) og 355 nm (ultraviolet) . Yderligere laserbølgelængder er tilgængelige til specialiserede applikationer. Derudover er der instrumenter, som har erstattet PMT'er med lavinefotodioder (APD) til fluorescensdetektion med det formål at øge følsomheden.

Akustiske fokuseringscytometre

Dette cytometer bruger ultralydsbølger til bedre at fokusere celler til laserforespørgsel. Denne type akustisk fokusering giver mulighed for højere prøveinput og mindre prøvetilstopning. Dette cytometer kan bruge op til 4 lasere og 14 fluorescenskanaler.

Cellesortering

En specifik type traditionelt flowcytometer er cellesorteringen, som kan oprense og indsamle prøver til yderligere analyse. En cellesorteringsindretning tillader brugeren at vælge (port) på en population af celler eller partikler, som er positiv (eller negativ) for de ønskede parametre og derefter dirigere disse celler ind i en opsamlingsbeholder. Cellesorteringsenheden adskiller cellerne ved at oscillere prøvestrømmen af ​​væske ved en høj frekvens for at generere dråber. Dråberne får derefter enten en positiv eller negativ ladning og føres gennem metalafbøjningsplader, hvor de ledes til en specifik opsamlingsbeholder baseret på deres ladning. Opsamlingskarrene kan være rør, objektglas eller plader (96-brønd eller 384-brønd er almindelige).

Der er to typer cellesortere, kvartskuvette og “jet-in-air”, der adskiller sig i, hvor laserinterrogationspunktet er placeret. Kvartskuvettecellesorteringsapparatet har fast laserjustering og er nemmere at forberede til en sortering. “jet in air” cellesortererne skal have laserne justeret dagligt og er sværere at sætte op, men er mere tilpassede til detektion af små partikler.

Billeddannelsescytometre

Imaging flowcytometre (IFC) kombinerer traditionel flowcytometri med fluorescensmikroskopi. Dette giver mulighed for hurtig analyse af en prøve for morfologi og multi-parameter fluorescens på både et enkelt celle- og populationsniveau (Barteneva, Fasler-Kan, & Vorobjev, 2012). IFC kan spore proteinfordelinger inden for individuelle celler som et konfokalt eller fluorescensmikroskop, men også til at behandle et stort antal celler som et flowcytometer. De er særligt nyttige i flere applikationer såsom cellesignalering, co-lokaliseringsundersøgelser, celle til celle-interaktioner, DNA-beskadigelse og reparation og enhver applikation, der skal være i stand til at koordinere cellulær placering med fluorescensekspression på store populationer af celler.

Masse cytometre

Massecytometre kombinerer time-of-flight massespektrometri og flowcytometri. Celler mærkes med tungmetalion-mærkede antistoffer (normalt fra lanthanid-serien) i stedet for fluorescensmærkede antistoffer og detekteres ved brug af time-of-flight massespektrometri. Massecytometre har ikke FSC- eller SSC-lysdetektion, som ikke tillader den konventionelle metode til påvisning af celleaggregater. Imidlertid kan andre metoder såsom cellestregkodning anvendes til dette formål (Leipold, Newell, & Maecker, 2015). Massecytometri har heller ikke cellulære autofluorescerende signaler, og reagenser har ikke det emissionsspektrale overlap forbundet med fluorescerende mærker, så kompensation er ikke nødvendig. Imidlertid ødelægges prøven under analyse, så cellesortering er ikke mulig, og optagelseshastigheden er meget lavere end et standard flowcytometer (1000 celler/sekund i stedet for 10.000 celler/sekund). I øjeblikket er der kommercielt tilgængelige reagenser til 40 kanaler, men dette antal vil stige med introduktionen af ​​andre metalioner såsom platin til konjugering til antistoffer (Mei, Leipold, & Maecker, 2016).

Cytometre til perlearray-analyse

Multiplex perlearrays er blevet populære til at analysere store mængder analytter i små prøvevolumener. Kort fortalt anvender disse assays indfangningsperler med en kendt mængde fluorescens i en specifik kanal og et reportermolekyle detekteret af en separat laser for at kvantificere mængden af ​​indfanget analyt forbundet med den specifikke perle. Det svarer i det væsentlige til 100 ELISA-assays.

Små flowcytometre med sædvanligvis 2 lasere og 96-brønds loadere er blevet udviklet til at analysere disse assays. Disse instrumenter har små fodspor og optiske bænkdesign, der er optimeret til at detektere og skelne perler med forskellige mængder af fluorescens langs to kanaler. Der er udviklet instrumenter, der kan detektere 100� forskellige perlekombinationer.

Spektralanalysatorer

En af udfordringerne ved multi-parameter flowcytometri er kompensation (eller sletning af spektral overlap) mellem flurochromer. En ny type flowcytometer, spektralanalysatoren er specielt designet til at løse dette problem. En spektralanalysator måler hele fluorescerende emissionsspektrene for hver fluorokrom i en flerfarvet prøve for at skabe et spektralt fingeraftryk. Under analysen er hvert spektre ublandet for at give et rent signal for hver fluorokrom (Sony, 2017). Spektralanalyse begynder at erstatte traditionelle PMT'er som en detektionsmetode til højdimensionel flowcytometri.

Nye detektorteknologier

Fotomultiplikatorrør (PMT'er) forbliver standarddetektorteknologien til flowcytometri. Deres høje følsomhed og lave baggrunde gør dem nyttige til fluorescensteknologi. Faststofdetektorer begynder dog at dukke op i nogle cytometre. Lavinefotodioder (APD'er) er billige, følsomme og meget lineære og reagerer mere spektralt i det lange røde område. Siliciumfotodioder (SiPD'er) er også en lovende mulighed for solid state-detektorer.


Fluorescens

I 2005 købte Active Motif Chromeon GmbH, en tysk virksomhed etableret i 2001 af professor Otto Wolfbeis, en af ​​verdens førende inden for fluorescerende biosensorer. Chromeon GmbH havde tidligt identificeret behovet for at udvikle forbedrede fluorescensbaserede biologiske analyser.

Ved at parre analyseudviklingen af ​​Active Motif med Chromeons fluorescerende kemi stræber vi efter at udvikle innovative celle- og molekylærbiologiske assays, der inkorporerer de proprietære fluorescerende farvestoffer og substrater udviklet af Chromeon GmbH. Active Motif Chromeo-farvestoffer giver følsomhed og fleksibilitet og udviser overlegne luminescensegenskaber, herunder en bred vifte af fluorescensexcitation og -emission, store Stokes-skift, begrænset fotoblegning og en bred pH-tolerance.

Fluorescerende mikroskopi med fluorescensmærkede antistoffer (Immunofluorescens eller IF) bruges i vid udstrækning til at påvise specifikke proteiner i deres cellulære miljø og til at besvare spørgsmål vedrørende deres lokalisering, modifikation, interaktioner og livscyklus. Indtil for nylig har brugen af ​​fluorescensmikroskopi i cellebiologiforskning imidlertid været begrænset af den opløsning, der kan opnås i billeddiagnostiske eksperimenter.

Opløsningen af ​​billeder er begrænset til størrelsen af ​​det sted, som mikroskopets excitationsstråle kan fokuseres på. Dette afhænger af bølgelængden af ​​det udsendende lys og instrumentets parametre. Den højest opnåelige opløsning er defineret af Abbes lov:

Figur 1: Abbe-loven beskriver den opløsning, der er opnåelig i mikroskopi.

x = rumlig opløsning lambda = bølgelængde af det exciterede lys
2n sin &alpha = mikroskopets numeriske blænde

Det Abbe grænse begrænser observatørens evne til visuelt at opløse objekter adskilt med mindre end

200 nm. Dette gør det umuligt at studere mindre bakterier, vira, ribosomer eller proteinklynger ved fluorescensmikroskopi. Inden for de sidste par år er der imidlertid udviklet adskillige nye teknologier, der overvinder denne begrænsning.

Super-opløsning fluorescens mikroskopi (også kendt som højopløsningsmikroskopi) beskriver en gruppe af teknikker, der &ldquobryder&rdquo&rdquo”diffraktionsbarrieren, hvilket gør det muligt for opløsningen at være så lav som 20-30 nm. Disse teknikker drager fordel af specielle fysik- og instrumentindstillinger og egenskaberne af højkvalitets fluorescerende farvestoffer til at forbedre opløsningen dramatisk. Selvom disse teknikker kan adskilles i to forskellige tilgange, har de et fælles grundlag: evnen til at slukke for fluorescerende molekyler, når det ønskes.

Figur 2: Active Motifs primære antistoffer og fluorescerende sekundære antistoffer i konfokal og STED-mikroskopi.

HeLa-celler blev farvet med alfa-tubulin-muse-mAb (klon 5-B-1-2) og ATTO 647N (STED/GSD) gede-anti-muse-IgG (katalognr. 15038). Histone H3 blev farvet med Histone H3 trimethyl Lys4 kanin polyklonalt antistof (katalog nr. 39159) og Chromeo 488 Goat anti-kanin IgG (katalog nr. 15041) sekundært antistof. De konfokale (venstre) og STED (højre) billeder er udlånt af Leica Microsystems, Tyskland.

Superopløsning ved direkte optisk billeddannelse

Den første tilgang er baseret på konfokal mikroskopi, hvor molekyler i de ydre områder af brændpunktet er slukket. Dette reducerer størrelsen af ​​den fluorescerende plet, da kun farvestoffer i midten af ​​excitationsområdet får lov til at udsende fluorescens. STED (STimuleret Emission Depletion) og STED CW (Ckontinuert Wave) tilhører disse direkte optiske billeddannelsesteknikker. De kræver ikke nogen beregningsmæssig evaluering, da prøverne scannes på normal vis. For mere information besøg venligst vores STED mikroskopi produkter sider.

Superopløsning ved lokalisering

I denne tilgang bliver størstedelen af ​​molekylerne i det exciterede område forvandlet til en mørk tilstand, kun nogle enkelte farvestofmolekyler får lov til at udsende fluorescerende lys. Placeringen af ​​disse individuelle molekyler bestemmes af en matematisk algoritme, og hver er visualiseret. Ved at gentage cyklussen med at slukke for farvestoffer og detektere fluorescensen af ​​de resterende individuelle emittere, skabes tusindvis af billeder, disse billeder kombineres for at danne det endelige højopløselige billede. Adskillige teknikker tilhører denne klasse af stokastisk udlæsning af individuel molekylelokalisering: STORM (STokastisk Optisk Reconstruction Mikroskopi), HÅNDFLADE (PhotoENaktiveret Lokalisering Mikroskopi) og GSDIM (Grund State Depletion med jegindividuelle Molecule return). For mere information om lokaliseringsbaseret mikroskopi, besøg venligst vores GSDIM mikroskopi produkter sider.

Med højopløsningsmikroskopi er det muligt at overskride Abbe-grænsen og opnå opløsningsforbedringer på op til 12 gange i forhold til klassisk konfokalmikroskopi. Evnen til at udføre billeddannelseseksperimenter ved opløsninger under 50 nm letter adskillelsen af subcellulære strukturer som tidligere ikke kunne løses, og øger tilliden til de biologiske roller af proteiner og strukturer, der co-lokaliserer.


Opdagelse

Opdagelse opnås typisk ved anvendelse af en af ​​to metoder: (a) kolorimetrisk eller enzymmedieret detektion og (b) fluorescensbaseret detektion.

I den kolorimetrisk metodeDet bundne primære eller sekundære antistof er konjugeret til et substrat, som giver et udfældende produkt, når det omdannes af et enzym. Dette bundfald er synligt som farvet farvning, når det ses ved lysmikroskopi.

I den fluorescens-baseret detektion metode, er antistof bundet til antigenet af interesse i vævet direkte eller indirekte konjugeret til en fluorofor (også nogle gange kaldet en fluorokrom), et molekyle, der fluorescerer i nærvær af lys med en specifik bølgelængde.


12.2H: Fluorescerende antistoffer - Biologi

Opdagelsen af ​​grønt fluorescerende protein i begyndelsen af ​​1960'erne indvarslede i sidste ende en ny æra inden for cellebiologi ved at gøre det muligt for efterforskere at anvende molekylære kloningsmetoder, fusionere fluorofordelen til en lang række protein- og enzymmål for at overvåge cellulære processer i levende systemer ved hjælp af optisk mikroskopi og relateret metodik.Koblet til de seneste tekniske fremskridt inden for bredfeltsfluorescens og konfokalmikroskopi, herunder ultrahurtige digitale kameraer med lavt lysniveau og multitracking-laserkontrolsystemer, har det grønne fluorescerende protein og dets farveskiftede genetiske derivater vist uvurderlig service i mange tusinde af levende celle-billeddannelseseksperimenter .

Figur 1 - Fluorescerende proteinmærker i levende celler

Osamu Shimomura og Frank Johnson, der arbejdede ved Friday Harbor Laboratories ved University of Washington i 1961, isolerede først et calciumafhængigt bioluminescerende protein fra Aequorea victoria vandmænd, som de navngav aequorin. Under isoleringsproceduren blev der observeret et andet protein, der manglede de blå-emitterende bioluminescerende egenskaber af aequorin, men var i stand til at producere grøn fluorescens, når det blev belyst med ultraviolet lys. På grund af denne egenskab blev proteinet til sidst døbt med det uhøjtidelige navn grønt fluorescerende protein (GFP). I løbet af de næste to årtier fastslog forskere, at aequorin og det grønne fluorescerende protein arbejder sammen i vandmændenes lysorganer for at konvertere calcium-inducerede selvlysende signaler til den grønne fluorescens, der er karakteristisk for arten.

Selvom genet for grønt fluorescerende protein først blev klonet i 1992, blev det betydelige potentiale som en molekylær probe ikke realiseret før flere år senere, da fusionsprodukter blev brugt til at spore genekspression i bakterier og nematoder. Siden disse tidlige undersøgelser er grønt fluorescerende protein blevet konstrueret til at producere et stort antal forskelligt farvede mutanter, fusionsproteiner og biosensorer, der bredt omtales som fluorescerende proteiner. For nylig er fluorescerende proteiner fra andre arter blevet identificeret og isoleret, hvilket resulterer i yderligere udvidelse af farvepaletten. Med den hurtige udvikling af fluorescerende proteinteknologi er nytten af ​​denne genetisk kodede fluorofor til et bredt spektrum af anvendelser ud over den simple sporing af mærkede biomolekyler i levende celler nu ved at blive fuldt ud værdsat.

Illustreret i figur 1 er to eksempler på multipel fluorescerende proteinmærkning i levende celler ved hjælp af fusionsprodukter rettet mod subcellulære (organelle) lokaliteter. Opossum nyrecortex proximal tubuli epitelcelle (Okay linje) præsenteret i Figur 1(a) blev transficeret med en cocktail af fluorescerende proteinvarianter fusioneret til peptidsignaler, der medierer transport til enten kernen (forstærket cyan fluorescerende protein ECFP), mitokondrierne (DsRed fluorescerende protein DsRed2FP), eller mikrotubulus-netværket (forstærket grønt fluorescerende protein EGFP). En lignende prøve bestående af humane cervikale adenokarcinomepitelceller (HeLa linje) er afbildet i Figur 1(b). HeLa-cellerne blev co-transficeret med subcellulære lokaliseringsvektorer fusioneret til cyan (mTurkis) og gul (mVenus) fluorescerende proteinkodende sekvenser (henholdsvis Golgi-komplekset og kernen), såvel som "Fruit"-proteinet, mCherry, der målretter mitokondrielle netværk.

Grønt fluorescerende protein og dets muterede alleliske former, blå, cyan og gule fluorescerende proteiner bruges til at konstruere fluorescerende kimære proteiner, der kan udtrykkes i levende celler, væv og hele organismer efter transfektion med de konstruerede vektorer. Røde fluorescerende proteiner er blevet isoleret fra andre arter, herunder koralrevsorganismer, og er tilsvarende nyttige. Den fluorescerende proteinteknik undgår problemet med at oprense, mærke og indføre mærkede proteiner i celler eller opgaven med at producere specifikke antistoffer for overflade- eller interne antigener.

Egenskaber og ændringer af Aequorea victoria grønt fluorescerende protein

Blandt de vigtigste aspekter af det grønne fluorescerende protein at værdsætte er, at hele den 27 kiloDalton native peptidstruktur er afgørende for udviklingen og vedligeholdelsen af ​​dets fluorescens. Det er bemærkelsesværdigt, at den principielle fluorofor er afledt af en triplet af tilstødende aminosyrer: serin-, tyrosin- og glycinresterne på lokationerne 65, 66 og 67 (omtalt som Ser65, Tyr66, og Gly67 se Figur 2). Selvom dette simple aminosyremotiv er almindeligt forekommende i hele naturen, resulterer det generelt ikke i fluorescens. Det unikke for det fluorescerende protein er, at placeringen af ​​denne peptidtriplet ligger i midten af ​​en bemærkelsesværdig stabil tøndestruktur bestående af 11 beta-ark foldet til et rør.

I det hydrofobe miljø i midten af ​​det grønne fluorescerende protein sker der en reaktion mellem carboxylcarbonet i Ser65 og aminonitrogenet i Gly67, hvilket resulterer i dannelsen af ​​et imidazolin-5-on heterocyklisk nitrogenringsystem (som illustreret i Figur 2). Yderligere oxidation resulterer i konjugering af imidazolinringen med Tyr66 og modning af en fluorescerende art. Det er vigtigt at bemærke, at den native grønne fluorescerende proteinfluorofor findes i to tilstande. En protoneret form, den dominerende tilstand, har et excitationsmaksimum ved 395 nanometer og en mindre udbredt, uprotoneret form, der absorberer ved cirka 475 nanometer. Uanset excitationsbølgelængden har fluorescensemission dog en maksimal topbølgelængde på 507 nanometer, selvom toppen er bred og ikke veldefineret.

Figur 2 - Grøn Fluorescerende Protein Fluorophore Modning

To fremherskende træk ved den fluorescerende proteinfluorofor har vigtige implikationer for dens anvendelighed som en probe. For det første er de fotofysiske egenskaber af grønt fluorescerende protein som en fluorofor ret komplekse, og derfor kan molekylet rumme en betydelig mængde modifikation. Mange undersøgelser har fokuseret på at finjustere fluorescensen af ​​naturligt grønt fluorescerende protein for at give en bred vifte af molekylære prober, men det mere betydelige og enorme potentiale ved at anvende proteinet som et udgangsmateriale til at konstruere avancerede fluoroforer kan ikke undervurderes. Det andet vigtige træk ved grønt fluorescerende protein er, at fluorescens er meget afhængig af den molekylære struktur, der omgiver tripeptidfluoroforen.

Denaturering af grønt fluorescerende protein ødelægger fluorescens, som man kunne forvente, og mutationer til rester, der omgiver tripeptidfluoroforen, kan dramatisk ændre fluorescensegenskaberne. Pakningen af ​​aminosyrerester inde i beta tønden er ekstremt stabil, hvilket resulterer i et meget højt fluorescenskvanteudbytte (op til 80 procent). Denne tætte proteinstruktur giver også modstand mod fluorescensvariationer på grund af fluktuationer i pH, temperatur og denatureringsmidler såsom urinstof. Det høje stabilitetsniveau ændres generelt på en negativ måde af mutationer i grønt fluorescerende protein, der forstyrrer fluorescens, hvilket resulterer i en reduktion af kvanteudbytte og større miljøfølsomhed. Selvom flere af disse defekter kan overvindes af yderligere mutationer, er afledte fluorescerende proteiner generelt mere følsomme over for miljøet end de oprindelige arter. Disse begrænsninger bør overvejes seriøst, når man designer eksperimenter med genetiske varianter.

For at tilpasse fluorescerende proteiner til brug i pattedyrsystemer blev der foretaget adskillige grundlæggende modifikationer af det grønne fluorescerende vildtypeprotein og findes nu i alle almindeligt anvendte varianter. Det første skridt var at optimere modningen af ​​fluorescens til et 37-graders celsius-miljø. Modning af vildtype-fluoroforen er ret effektiv ved 28 grader, men at øge temperaturen til 37 grader reducerer den samlede modning væsentligt og resulterer i nedsat fluorescens. Mutation af phenylalanin-resten i position 64 (Phe64) til leucin resulterer i forbedret modning af fluorescens ved 37 grader, hvilket mindst svarer til det, der observeres ved 28 grader. Denne mutation er til stede i de mest populære varianter af fluorescerende proteiner afledt af Aequorea victoria, men er ikke den eneste mutation, der forbedrer foldning ved 37 grader, da andre varianter er blevet opdaget.

Ud over at forbedre modningen ved 37 grader har optimeringen af ​​kodonbrug til pattedyrsekspression også forbedret den generelle lysstyrke af grønt fluorescerende protein udtrykt i pattedyrsceller. I alt er over 190 tavse mutationer blevet introduceret i den kodende sekvens for at øge ekspression i humant væv. Et Kozak translationsinitieringssted (indeholdende nukleotidsekvensen A/GCCAT) blev også introduceret ved insertion af valin som den anden aminosyre. Disse har sammen med en række andre forbedringer (diskuteret nedenfor) resulteret i en meget nyttig probe til levende cellebilleddannelse af pattedyrsceller og er fælles for alle de aktuelt anvendte fluorescerende prober afledt af det originale vandmandsprotein.

Den fluorescerende proteinfarvepalet

Der er udviklet en bred vifte af genetiske varianter af fluorescerende proteiner, der har spektrale fluorescens-emissionsprofiler, der spænder over næsten hele spektret af synligt lys (se tabel 1). Mutagenese indsats i originalen Aequorea victoria vandmænd grønt fluorescerende protein har resulteret i nye fluorescerende prober, der varierer i farve fra blå til gul, og er nogle af de mest udbredte in vivo reportermolekyler i biologisk forskning. Længere bølgelængde fluorescerende proteiner, der udsender i de orange og røde spektralområder, er blevet udviklet fra havanemonen, Discosoma striata, og revkoraller tilhørende klassen Anthozoa. Endnu andre arter er blevet udvundet for at producere lignende proteiner med cyan, grøn, gul, orange og dyb rød fluorescensemission. Udviklingsforskningsindsatsen er i gang for at forbedre lysstyrken og stabiliteten af ​​fluorescerende proteiner og dermed forbedre deres overordnede anvendelighed.

Tabel 1 - Fluorescerende proteinegenskaber

Protein
(Akronym)
Excitation
Maksimum
(nm)
Udledning
Maksimum
(nm)
Kindtand
Udryddelse
Koefficient
Kvante
Udbytte
in vivo
Struktur
I forhold
Lysstyrke
(% af EGFP)
GFP (vægt)395/47550921,0000.77Monomer*48
Grønne fluorescerende proteiner
EGFP48450756,0000.60Monomer*100
Smaragd48750957,5000.68Monomer*116
Superfolder GFP48551083,3000.65Monomer*160
Azami Grøn49250555,0000.74Monomer121
mWasabi49350970,0000.80Monomer167
TagGFP48250558,2000.59Monomer*110
TurboGFP48250270,0000.53Dimer102
AcGFP48050550,0000.55Monomer*82
ZsGreen49350543,0000.91Tetramer117
T-Safir39951144,0000.60Monomer*79
Blå fluorescerende proteiner
EBFP38344529,0000.31Monomer*27
EBFP238344832,0000.56Monomer*53
Azurit38445026,2000.55Monomer*43
mTagBFP39945652,0000.63Monomer98
Cyan fluorescerende proteiner
ECFP43947632,5000.40Monomer*39
mECFP43347532,5000.40Monomer39
Cerulean43347543,0000.62Monomer*79
mTurkis43447430,0000.84Monomer*75
CyPet43547735,0000.51Monomer*53
AmCyan145848944,0000.24Tetramer31
Midori-Ishi Cyan47249527,3000.90Dimer73
TagCFP45848037,0000.57Monomer63
mTFP1 (Teal)46249264,0000.85Monomer162
Gule fluorescerende proteiner
EYFP51452783,4000.61Monomer*151
Topaz51452794,5000.60Monomer*169
Venus51552892,2000.57Monomer*156
mCitrin51652977,0000.76Monomer174
YPet517530104,0000.77Monomer*238
TagYFP50852464,0000.60Monomer118
PhiYFP525537124,0000.39Monomer*144
ZsYellow152953920,2000.42Tetramer25
mBanan5405536,0000.7Monomer13
Orange fluorescerende proteiner
Kusabira Orange54855951,6000.60Monomer92
Kusabira Orange255156563,8000.62Monomer118
mOrange54856271,0000.69Monomer146
mOrange254956558,0000.60Monomer104
dTomat55458169,0000.69Dimer142
dTomat-Tandem554581138,0000.69Monomer283
TagRFP555584100,0000.48Monomer142
TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99
DsRed55858375,0000.79Tetramer176
DsRed256358243,8000.55Tetramer72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58
DsRød-Monomer55658635,0000.10Monomer10
mTangerine56858538,0000.30Monomer34
Røde fluorescerende proteiner
mRuby558605112,0000.35Monomer117
mApple56859275,0000.49Monomer109
mStrawberry57459690,0000.29Monomer78
AsRød257659256,2000.05Tetramer8
mRFP158460750,0000.25Monomer37
JRed58461044,0000.20Dimer26
mCherry58761072,0000.22Monomer47
HcRed158861820,0000.015Dimer1
mHindbær59862586,0000.15Monomer38
dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21
HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19
mPlum59064941,0000.10Monomer12
AQ14359565590,0000.04Tetramer11
* Svag Dimer

Præsenteret i tabel 1 er en samling af egenskaber, der vises af flere af de mest populære og nyttige fluorescerende proteinvarianter. Sammen med det almindelige navn og/eller akronym for hvert fluorescerende protein, maksimale absorptions- og emissionsbølgelængder (angivet i nanometer), molær ekstinktionskoefficient, kvanteudbytte, relativ lysstyrke og in vivostrukturelle foreninger er opført. De beregnede lysstyrkeværdier blev afledt af produktet af den molære ekstinktionskoefficient og kvanteudbytte divideret med værdien for EGFP. Denne fortegnelse blev oprettet ud fra videnskabelige og kommercielle litteraturressourcer og er ikke beregnet til at være omfattende, men repræsenterer i stedet fluorescerende proteinderivater, der har fået stor opmærksomhed i litteraturen og kan vise sig værdifulde i forskningsindsatsen. Desuden blev absorptions- og fluorescensemissionsspektrene anført i tabeller og illustreret nedenfor registreret under kontrollerede forhold og er kun normaliseret til sammenligning og visningsformål. I egentlige fluorescensmikroskopiundersøgelser kan spektralprofiler og bølgelængdemaksima variere på grund af miljøpåvirkninger, såsom pH, ionkoncentration og opløsningsmiddelpolaritet, såvel som fluktuationer i lokaliseret probekoncentration. Derfor kan de anførte ekstinktionskoefficienter og kvanteudbytter afvige fra dem, der faktisk er observeret under eksperimentelle forhold.

Grønne fluorescerende proteiner

Selvom naturligt grønt fluorescerende protein producerer betydelig fluorescens og er ekstremt stabilt, er excitationsmaksimum tæt på det ultraviolette område. Fordi ultraviolet lys kræver særlige optiske overvejelser og kan beskadige levende celler, er det generelt ikke velegnet til billeddannelse af levende celler med optisk mikroskopi. Heldigvis forskydes excitationsmaksimumet for grønt fluorescerende protein let til 488 nanometer (i det cyanområde) ved at indføre en enkeltpunktsmutation, der ændrer serinen i position 65 til en threoninrest (S65T). Denne mutation findes i den mest populære variant af grønt fluorescerende protein, kaldet forbedret GFP (EGFP), som er kommercielt tilgængelig i en lang række vektorer, der tilbydes af BD Biosciences Clontech, en af ​​førende inden for fluorescerende proteinteknologi. Desuden kan den forbedrede version afbildes ved hjælp af almindeligt tilgængelige filtersæt designet til fluorescein og er blandt de lyseste af de aktuelt tilgængelige fluorescerende proteiner. Disse funktioner har gjort forbedret grønt fluorescerende protein til en af ​​de mest populære prober og det bedste valg til de fleste single-label fluorescerende proteineksperimenter. De eneste ulemper ved brugen af ​​EGFP er en lille følsomhed over for pH og en svag tendens til at dimerisere.

Ud over forbedret grønt fluorescerende protein bliver flere andre varianter i øjeblikket brugt til billeddannelse af levende celler. En af de bedste af disse med hensyn til fotostabilitet og lysstyrke kan være Smaragd variant, men mangel på en kommerciel kilde har begrænset brugen af ​​den. Adskillige kilder leverer humaniserede grønne fluorescerende proteinvarianter, der tilbyder klare fordele for fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) eksperimenter. Substitution af phenylalanin-resten i position 64 for leucin (F64L GFP2) giver en mutant, der bevarer 400 nanometer excitationstoppen og kan kobles som en effektiv partner til forstærket gult fluorescerende protein. En variant af S65C mutation (normalt substituerer cystein med serin) med en topexcitation ved 474 nanometer er blevet introduceret kommercielt som en mere egnet FRET-partner til forstærket blåt fluorescerende protein end den rødforskudte forstærkede grønne version. Endelig et koralrevprotein, kaldet ZsGrøn1 og med en emissionstop på 505 nanometer, er blevet introduceret som en erstatning for forbedret grønt fluorescerende protein. Når det udtrykkes i pattedyrsceller, er ZsGreen1 meget lys i forhold til EGFP, men har begrænset anvendelighed til at producere fusionsmutanter og har, i lighed med andre revkoralproteiner, en tendens til at danne tetramerer.

Gule fluorescerende proteiner

Familien af ​​gule fluorescerende proteiner blev initieret efter krystalstrukturen af ​​grønt fluorescerende protein afslørede, at threoninrest 203 (Thr203) var nær kromoforen. Mutation af denne rest til tyrosin blev indført for at stabilisere det exciterede dipolmoment af kromoforen og resulterede i et 20 nanometer skift til længere bølgelængder for både excitations- og emissionsspektrene. Yderligere justeringer førte til udviklingen af forbedret gult fluorescerende protein (EYFP), som er et af de lyseste og mest udbredte fluorescerende proteiner. Lysstyrken og fluorescensemissionsspektret af forbedret gult fluorescerende protein kombineres for at gøre denne probe til en fremragende kandidat til flerfarvebilleddannelseseksperimenter i fluorescensmikroskopi. Forbedret gult fluorescerende protein er også nyttigt til energioverførselsforsøg, når det parres med forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) eller GFP2. Imidlertid giver gult fluorescerende protein nogle problemer, idet det er meget følsomt over for sur pH og mister cirka 50 procent af dets fluorescens ved pH 6,5. Derudover har EYFP også vist sig at være følsom over for chloridioner og fotoblegemidler meget lettere end de grønne fluorescerende proteiner.

Figur 3 - Spektralprofiler af almindelige fluorescerende proteiner

Fortsat udvikling af fluorescerende proteinarkitektur til gul emission har løst flere af problemerne med de gule prober. Det Citrin variant af gult fluorescerende protein er meget lys i forhold til EYFP og har vist sig at være meget mere modstandsdygtig over for fotoblegning, sur pH og andre miljøpåvirkninger. Et andet afledt navn Venus, er den hurtigst modne og en af ​​de lyseste gule varianter udviklet til dato. Koralrevsproteinet, ZsYellow1, oprindeligt klonet fra en Zoanthus arter hjemmehørende i det Indiske og Stillehav, producerer ægte gul emission og er ideel til flerfarvede applikationer. Ligesom ZsGreen1 er dette derivat ikke så nyttigt til at skabe fusioner som EYFP og har en tendens til at danne tetramerer. Mange af de mere robuste gule fluorescerende proteinvarianter har været vigtige for kvantitative resultater i FRET-undersøgelser og er potentielt også nyttige til andre undersøgelser.

Illustreret i Figur 3 er absorptions- og emissionsspektralprofilerne for mange af de almindeligt anvendte og kommercielt tilgængelige fluorescerende proteiner, som spænder over det synlige spektrum fra cyan til langt rødt. Varianterne stammer fra Aequorea victoria vandmænd, herunder forbedrede cyan, grønne og gule fluorescerende proteiner, udviser maksimale emissionsbølgelængder, der spænder fra 425 til 525 nanometer. Fluorescerende proteiner afledt af koralrev, DsRed2 og HcRed1 (diskuteret nedenfor), udsender længere bølgelængder, men lider af oligomeriseringsartefakter i pattedyrsceller.

Blå og cyan fluorescerende proteiner

De blå og cyan varianter af grønt fluorescerende protein resulterede fra direkte modifikation af tyrosinresten i position 66 (Tyr66) i den native fluorofor (se Figur 2). Omdannelse af denne aminosyre til histidin resulterer i blå emission med et bølgelængdemaksimum ved 450 nanometer, hvorimod omdannelse til tryptamin resulterer i en større fluorescenstop omkring 480 nanometer sammen med en skulder, der topper omkring 500 nanometer.Begge prober er kun svagt fluorescerende og kræver sekundære mutationer for at øge foldningseffektiviteten og den generelle lysstyrke. Selv med modifikationer er de forbedrede versioner i denne klasse af fluorescerende protein (EBFP og ECFP) er kun omkring 25 til 40 procent så lyse som forbedret grønt fluorescerende protein. Derudover er excitation af blå og cyan fluorescerende proteiner mest effektiv i spektrale områder, der ikke er almindeligt anvendte, så specialiserede filtersæt og laserkilder er påkrævet.

På trods af ulemperne ved blå og cyan fluorescerende proteiner har den udbredte interesse for flerfarvet mærkning og FRET populariseret deres anvendelse i en række undersøgelser. Dette gælder især for forbedret cyan fluorescerende protein, som kan exciteres off-peak af en argon-ion laser (ved hjælp af 457-nanometer spektral linje) og er betydeligt mere modstandsdygtig over for fotoblegning end det blå derivat. I modsætning til andre fluorescerende proteiner har der ikke været en høj grad af interesse for at designe bedre prober i det blå område af det synlige lysspektrum, og størstedelen af ​​udviklingsforskningen på fluoroforer i denne klasse har været fokuseret på cyanvarianter.

Figur 4 - Spektralprofiler af fluorescerende protein FRET spandevarianter

Blandt de forbedrede cyan fluorescerende proteiner, der er blevet introduceret, AmCyan1 og en forbedret cyan variant kaldet Cerulean vise mest lovende. Afledt af korallrev, Anæmi majanoAmCyan1 fluorescerende proteinvarianten er blevet optimeret med humane kodoner for at generere et højt relativ lysstyrkeniveau og modstandsdygtighed over for fotoblegning sammenlignet med forbedret cyanfluorescerende protein under pattedyrsekspression. På den negative side, i lighed med de fleste andre revkoralproteiner, har denne sonde en tendens til at danne tetramere. Cerulean fluorescerende probe blev udviklet ved stedrettet mutagenese af forbedret cyan fluorescerende protein for at give en højere ekstinktionskoefficient og forbedret kvanteudbytte. Cerulean er mindst 2 gange lysere end forstærket cyan fluorescerende protein og har vist sig at øge signal-til-støj-forholdet signifikant, når det kobles med gul-emitterende fluorescerende proteiner, såsom Venus (se Figur 4), i FRET-undersøgelser.

Røde fluorescerende proteiner

Et hovedmål for udvikling af fluorescerende proteiner er blevet konstruktionen af ​​et rødemitterende derivat, der svarer til eller overgår de avancerede egenskaber af forbedret grønt fluorescerende protein. Blandt fordelene ved et passende rødt fluorescerende protein er den potentielle kompatibilitet med eksisterende konfokale og bredfeltsmikroskoper (og deres filtersæt) sammen med en øget kapacitet til at afbilde hele dyr, som er væsentligt mere gennemsigtige for rødt lys. Fordi konstruktionen af ​​rødforskudte mutanter fra Aequorea victoria vandmænd grønt fluorescerende protein ud over den gule spektrale region har vist sig stort set mislykket, efterforskere har vendt deres søgning til de tropiske revkoraller.

Det første koral-afledte fluorescerende protein, der blev brugt i vid udstrækning, var afledt af Discosoma striata og er almindeligvis omtalt som DsRed. Når den er fuldt modnet, har fluorescensemissionsspektret af DsRed en top på 583 nanometer, hvorimod excitationsspektret har en større top på 558 nanometer og en mindre top omkring 500 nanometer. Der er dog flere problemer forbundet med at bruge DsRed. Modning af DsRed fluorescens sker langsomt og fortsætter gennem en periode, hvor fluorescensemission er i det grønne område. Benævnt grøn stat, har denne artefakt vist sig problematisk for flere mærkningseksperimenter med andre grønne fluorescerende proteiner på grund af den spektrale overlapning. Ydermere er DsRed en obligat tetramer og kan danne store proteinaggregater i levende celler. Selvom disse egenskaber er uden betydning for brugen af ​​DsRed som reporter af genekspression, er anvendeligheden af ​​DsRed som et epitopmærke stærkt begrænset. I modsætning til vandmænds fluorescerende proteiner, som med succes er blevet brugt til at mærke hundredvis af proteiner, har DsRed-konjugater vist sig meget mindre vellykkede og er ofte giftige.

Nogle få af problemerne med DsRed fluorescerende proteiner er blevet overvundet gennem mutagenese. Anden generation af DsRed, kendt som DsRed2, indeholder flere mutationer ved peptidaminoterminalen, der forhindrer dannelse af proteinaggregater og reducerer toksicitet. Desuden reduceres fluorophormodningstiden med disse modifikationer. DsRed2-proteinet danner stadig en tetramer, men det er mere kompatibelt med grønne fluorescerende proteiner i flere mærkningseksperimenter på grund af den hurtigere modning. Yderligere reduktioner i modningstid er blevet realiseret med den tredje generation af DsRed-mutanter, som også viser et øget lysstyrkeniveau i form af maksimal cellulær fluorescens. Rød fluorescensemission fra DsRed-Express kan observeres inden for en time efter ekspression, sammenlignet med ca. seks timer for DsRed2 og 11 timer for DsRed. En gær-optimeret variant, kaldet RedStar, er blevet udviklet, der også har en forbedret modningshastighed og øget lysstyrke. Tilstedeværelsen af ​​en grøn tilstand i DsRed-Express og RedStar er ikke synlig, hvilket gør disse fluorescerende proteiner til det bedste valg i det orange-røde spektralområde til flere mærkningseksperimenter. Fordi disse prober forbliver obligatoriske tetramerer, er de ikke det bedste valg til mærkning af proteiner.

Figur 5 - Spektralprofiler af orange og røde monometriske fluorescerende proteiner

Adskillige yderligere røde fluorescerende proteiner, der viser en betydelig mængde lovende, er blevet isoleret fra revkoralorganismerne. En af de første, der er tilpasset til pattedyranvendelser, er HcRed1, som var isoleret fra Heteractis crispa og er nu kommercielt tilgængelig. HcRed1 blev oprindeligt afledt af et ikke-fluorescerende kromoprotein, der absorberer rødt lys gennem mutagenese for at producere en svagt fluorescerende obligat dimer med et absorptionsmaksimum på 588 nanometer og et emissionsmaksimum på 618 nanometer. Selvom fluorescensemissionsspektret for dette protein er tilstrækkeligt til adskillelse fra DsRed, har det en tendens til at aggregere med DsRed og er langt mindre lyst. En interessant HcRed-konstruktion indeholdende to molekyler i tandem er blevet fremstillet for at overvinde dimerisering, der i princippet forekommer fortrinsvis inden for tandem-parringen for at producere et monomert mærke. Men fordi den overordnede lysstyrke af dette tvillingeprotein endnu ikke er blevet forbedret, er det ikke et godt valg til rutinemæssige anvendelser i levende cellemikroskopi.

Udvikling af monomere fluorescerende proteinvarianter

I deres naturlige tilstande eksisterer de fleste fluorescerende proteiner som dimerer, tetramerer eller højere ordens oligomerer. Ligeledes, Aequorea victoria grønt fluorescerende protein menes at deltage i et tetramerisk kompleks med aequorin, men dette fænomen er kun blevet observeret ved meget høje proteinkoncentrationer, og vandmændenes fluorescerende proteiners tendens til at dimerisere er generelt meget svag (med en dissociationskonstant større end 100 mikromolær). Dimerisering af fluorescerende proteiner er således generelt ikke blevet observeret, når de udtrykkes i pattedyrsystemer. Når fluorescerende proteiner er målrettet mod specifikke cellulære rum, såsom plasmamembranen, kan den lokaliserede proteinkoncentration imidlertid teoretisk blive høj nok til at tillade dimerisering. Dette er en særlig bekymring, når man udfører FRET-eksperimenter, som kan give komplekse datasæt, der let kompromitteres af dimeriseringsartefakter.

Konstruktionen af ​​monomere DsRed-varianter har vist sig at være en vanskelig opgave. Mere end 30 aminosyreændringer i strukturen var nødvendige for at skabe det første generations monomere DsRed-protein (kaldet RFP1). Dette derivat udviser imidlertid signifikant reduceret fluorescensemission sammenlignet med det native protein og fotobleger meget hurtigt, hvilket gør det meget mindre nyttigt end monomere grønne og gule fluorescerende proteiner. Mutageneseforskningsindsats, herunder nye teknikker såsom somatisk hypermutation, fortsætter i søgningen efter gule, orange, røde og dybrøde fluorescerende proteinvarianter, der yderligere reducerer disse potentielt effektive biologiske probers tendens til at selvassociere og samtidig skubbe emissionsmaksima mod længere bølgelængder.

Der udvikles forbedrede monomere fluorescerende proteiner, der har øgede ekstinktionskoefficienter, kvanteudbytter og fotostabilitet, selvom ingen enkelt variant endnu er blevet optimeret efter alle kriterier. Derudover bliver ekspressionsproblemerne med obligate tetramere røde fluorescerende proteiner overvundet af bestræbelserne på at generere monomere varianter, som har givet derivater, der er mere kompatible med biologisk funktion.

Den måske mest spektakulære udvikling på denne front har været introduktionen af ​​en ny høst af fluorescerende proteiner afledt af monomert rødt fluorescerende protein gennem rettet mutagenese rettet mod Q66 og Y67 rester. Opkaldt efter frugter, der reflekterer farver, der ligner fluorescensemissionens spektrale profil (se tabel 1 og Figur 5), udviser denne kadre af monomere fluorescerende proteiner maksima ved bølgelængder fra 560 til 610 nanometer. Yderligere udvidelse af denne klasse gennem iterativ somatisk hypermutation gav fluorescerende proteiner med emissionsbølgelængder op til 650 nanometer. Disse nye proteiner udfylder i det væsentlige hullet mellem de mest rødforskudte vandmænds fluorescerende proteiner (såsom Venus) og de røde fluorescerende proteiner fra koralrevet. Selvom flere af disse nye fluorescerende proteiner mangler den lysstyrke og stabilitet, der er nødvendig for mange billeddannelseseksperimenter, er deres eksistens opmuntrende, da det antyder eventualiteten af ​​lyse, stabile, monomere fluorescerende proteiner over hele det synlige spektrum.

Optiske highlightere

En af de mest interessante udviklinger inden for fluorescerende proteinforskning har været anvendelsen af ​​disse prober som molekylær eller optiske highlightere (se Tabel 2), som ændrer farve eller emissionsintensitet som følge af ekstern fotonstimulering eller tidens gang. Som et eksempel skaber en enkelt punktmutation til det native vandmandspeptid en fotoaktiverbar version af grønt fluorescerende protein (kendt som PA-GFP), der muliggør fotokonvertering af excitationstoppen fra ultraviolet til blå ved belysning med lys i 400 nanometer-området. Ukonverteret PA-GFP har en excitationstop svarende til profilen for vildtypeproteinet (ca. 395 til 400 nanometer). Efter fotokonvertering øges excitationsspidsen ved 488 nanometer ca. 100 gange. Denne hændelse fremkalder meget høje kontrastforskelle mellem de ukonverterede og konverterede puljer af PA-GFP og er nyttig til at spore dynamikken i molekylære subpopulationer i en celle. Illustreret i Figur 6(a) er en transficeret levende pattedyrscelle indeholdende PA-GFP i cytoplasmaet, der afbildes med 488-nanometer argon-ion laser excitation før (Figur 6(a)) og efter (Figur 6(d)) fotokonvertering med en 405 nanometer blå diodelaser.

Tabel 2 - Egenskaber for udvalgte optiske highlightere

Protein
(Akronym)
Excitation
Maksimum
(nm)
Udledning
Maksimum
(nm)
Kindtand
Udryddelse
Koefficient
Kvante
Udbytte
in vivo
Struktur
I forhold
Lysstyrke
(% af EGFP)
PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41
PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16
PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3
CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259
CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59
wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112
wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68
mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101
mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53
dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165
dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59
mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140
mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90
Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67
Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57
CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240
Kindling (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12

Andre fluorescerende proteiner kan også anvendes som optiske highlightere. Tre-foton excitation (ved mindre end 760 nanometer) af DsRed fluorescerende protein er i stand til at omdanne den normalt røde fluorescens til grøn. Denne effekt skyldes sandsynligvis selektiv fotoblegning af de røde kromoforer i DsRed, hvilket resulterer i observerbar fluorescens fra den grønne tilstand. Det Timer variant af DsRed skifter gradvist fra lysegrøn (500 nanometer emission) til lyserød (580 nanometer emission) i løbet af flere timer. Det relative forhold mellem grøn og rød fluorescens kan derefter bruges til at indsamle tidsmæssige data til genekspressionsundersøgelser.

En fotoskiftbar optisk highlighter, kaldet PS-CFP, afledt af mutagenese af en grønt fluorescerende proteinvariant, er blevet observeret at gå fra cyan til grøn fluorescens ved belysning ved 405 nanometer (bemærk fotokonvertering af den centrale celle i Figur 6(b) og 6(e)). Udtrykt som en monomer er denne probe potentielt nyttig i fotoblegning, fotokonvertering og fotoaktiveringsundersøgelser. Imidlertid er fluorescensen fra PS-CFP ca. 2,5 gange svagere end PA-GFP og er ringere end andre highlightere med hensyn til fotokonverteringseffektivitet (40 nanometer skiftet i fluorescensemission ved fotokonvertering er mindre end observeret med lignende prober). Yderligere mutagenese af dette eller beslægtede fluorescerende proteiner har potentialet til at give mere nyttige varianter i denne bølgelængderegion.

Figur 6 - Optisk highlighter, fluorescerende proteiner

Optiske highlightere er også blevet udviklet i fluorescerende proteiner klonet fra koraller og anemonearter. Kaede, et fluorescerende protein isoleret fra stenet koral, fotokonverteres fra grønt til rødt i nærvær af ultraviolet lys. I modsætning til PA-GFP sker omdannelsen af ​​fluorescens i Kaede ved absorption af lys, der er spektralt adskilt fra dets belysning. Desværre er dette protein en obligatorisk tetramer, hvilket gør det mindre egnet pelsbrug som et epitopmærke end PA-GFP. En anden tetramerisk stenet koral (Lobophyllia hemprichii) fluorescerende proteinvariant, benævnt EosFP (se Tabel 2), udsender lysegrøn fluorescens, der skifter til orange-rød, når den belyses med ultraviolet lys ved cirka 390 nanometer. I dette tilfælde produceres det spektrale skift af en foto-induceret modifikation, der involverer et brud i peptidrygraden, der støder op til kromoforen. Yderligere mutagenese af "vildtype" EosFP-proteinet gav monomere derivater, som kan være nyttige til konstruktion af fusionsproteiner.

En tredje ikke-Aequorea optisk highlighter, den Kindling fluorescerende protein (KFP1) er blevet udviklet fra et ikke-fluorescerende kromoprotein isoleret i Anemonia sulcata, og er nu kommercielt tilgængelig (Evrogen). Kindling fluorescerende protein udviser ikke emission, før det er oplyst med grønt lys. Lys med lav intensitet resulterer i en forbigående rød fluorescens, der henfalder i løbet af et par minutter (se mitokondrierne i Figur 6(c)). Belysning med blåt lys slukker den tændte fluorescens med det samme, hvilket tillader stram kontrol over fluorescerende mærkning. I modsætning hertil resulterer højintensitetsbelysning i irreversibel optænding og giver mulighed for stabil fremhævning svarende til PA-GFP (Figur 6(f)). Evnen til præcist at kontrollere fluorescens er særlig nyttig, når du sporer partikelbevægelser i et overfyldt miljø. For eksempel er denne tilgang med succes blevet brugt til at spore skæbnen for neurale pladeceller under udvikling Xenopus embryoner og bevægelsen af ​​individuelle mitokondrier i PC12-celler.

Efterhånden som udviklingen af ​​optiske highlightere fortsætter, bør fluorescerende proteiner, der er nyttige til optisk mærkning, udvikle sig mod lysere, monomere varianter, der let kan fotokonverteres og vise et bredt spektrum af emissionsfarver. Sammen med disse fremskridt vil mikroskoper, der er udstyret til jævnt at orkestrere mellem belysningstilstande til fluorescensobservation og regional mærkning, blive almindelige i cellebiologiske laboratorier. I sidste ende har disse innovationer potentialet til at opnå betydelige resultater inden for den rumlige og tidsmæssige dynamik i signaltransduktionssystemer.

Fluorescerende proteinvektorer og genoverførsel

Fluorescerende proteiner er ret alsidige og har med succes været anvendt i næsten alle biologiske discipliner fra mikrobiologi til systemfysiologi. Disse allestedsnærværende prober har været yderst nyttige som reportere til genekspressionsundersøgelser i dyrkede celler og væv såvel som levende dyr. I levende celler er fluorescerende proteiner mest almindeligt anvendt til at spore lokaliseringen og dynamikken af ​​proteiner, organeller og andre cellulære rum. En række forskellige teknikker er blevet udviklet til at konstruere fluorescerende proteinfusionsprodukter og forbedre deres ekspression i pattedyr og andre systemer. De primære vehikler til at introducere fluorescerende proteinkimære gensekvenser i celler er gensplejsede bakterieplasmider og virale vektorer.

Fluorescerende proteingenfusionsprodukter kan indføres i pattedyrceller og andre celler under anvendelse af den passende vektor (sædvanligvis et plasmid eller virus) enten forbigående eller stabilt. I forbigående eller midlertidige genoverførselsforsøg (ofte omtalt som forbigående transfektion), plasmid eller viralt DNA indført i værtsorganismen integreres ikke nødvendigvis i kromosomerne, men kan udtrykkes i cytoplasmaet i en kort periode. Ekspression af genfusionsprodukter, let overvåget ved observation af fluorescensemission ved anvendelse af et filtersæt, der er kompatibelt med det fluorescerende protein, finder sædvanligvis sted over en periode på adskillige timer efter transfektion og fortsætter i 72 til 96 timer efter indføring af plasmid-DNA i pattedyrsceller . I mange tilfælde kan plasmid-DNA'et inkorporeres i genomet i en permanent tilstand for at danne stabilt transformerede cellelinjer. Valget af forbigående eller stabil transfektion afhænger af undersøgelsens mål.

Figur 7 - EYFP endoplasmatisk retikulum lokaliseringsvektor

Den grundlæggende plasmidvektorkonfiguration, der er anvendelig i fluorescerende proteingenoverførselsforsøg, har adskillige nødvendige komponenter. Plasmidet skal indeholde prokaryote nukleotidsekvenser, der koder for en bakteriel replikationsstart for DNA og et antibiotikaresistensgen. Disse elementer, ofte betegnet shuttle sekvenser, tillader propagering og selektion af plasmidet i en bakterievært for at generere tilstrækkelige mængder af vektoren til pattedyrstransfektioner. Derudover skal plasmidet indeholde et eller flere eukaryote genetiske elementer, der styrer initieringen af ​​messenger-RNA-transkription, et pattedyrs polyadenyleringssignal, en intron (valgfrit) og et gen til co-selektion i pattedyrsceller. Transkriptionselementer er nødvendige for, at pattedyrværten kan udtrykke genfusionsproduktet af interesse, og selektionsgenet er sædvanligvis et antibiotikum, der giver resistens til celler, der indeholder plasmidet. Disse generelle træk varierer afhængigt af plasmiddesign, og mange vektorer har et bredt spektrum af yderligere komponenter, der er egnede til særlige anvendelser.

Illustreret i Figur 7 er restriktionsenzymet og det genetiske kort over et kommercielt tilgængeligt (BD Biosciences Clontech) bakterielt plasmidderivat, der indeholder kodningssekvensen for forstærket gult fluorescerende protein fusioneret til den endoplasmatiske reticulum-målretningssekvens af calreticulin (et resident protein). Ekspression af dette genprodukt i modtagelige pattedyrsceller giver et kimært peptid indeholdende EYFP lokaliseret til det endoplasmatiske retikulummembrannetværk, designet specifikt til fluorescerende mærkning af denne organel. Værtsvektoren er et derivat af pUC højt kopiantal (ca. 500) plasmid, der indeholder det bakterielle replikationsorigin, hvilket gør det velegnet til reproduktion i specialiserede E coli stammer. Kanamycin-antibiotikumgenet udtrykkes let i bakterier og giver resistens til at tjene som en selekterbar markør.

Yderligere funktioner ved EYFP-vektoren præsenteret ovenfor er et humant cytomegalovirus (CMV) promotor til at drive genekspression i transficerede humane og andre pattedyrcellelinjer, og en f1 bakteriofagreplikationsorigin for enkeltstrenget DNA-produktion. Vektorrygraden indeholder også et abevirus 40 (SV40) replikationsorigin, som er aktiv i pattedyrsceller, der udtrykker SV40 T-antigenet. Udvælgelse af stabile transfektanter med antibiotika G418 er aktiveret med en neomycinresistenskassette bestående af SV40 early promoter, neomycinresistensgenet (aminoglycosid 3'-phosphotransferase) og polyadenyleringssignaler fra herpes simplex virus thymidinkinase (HSV-TK) for messenger-stabilitet. Seks unikke restriktionsenzymsteder (se Figur 7) er til stede på plasmidrygraden, hvilket øger dette plasmids alsidighed.

Formering, isolering og transfektion af fluorescerende proteinplasmider

Succesfulde pattedyrstransfektionseksperimenter er afhængige af brugen af ​​højkvalitets plasmid- eller virale DNA-vektorer, der er relativt fri for bakterielle endotoksiner. I den native tilstand udviser cirkulære plasmid-DNA-molekyler en tertiær supercoiled konformation, der vrider den dobbelte helix om sig selv flere gange. I mange år var den valgte metode til supercoiled plasmid- og virus-DNA-rensning cæsiumchlorid-densitetsgradientcentrifugering i nærværelse af et interkalationsmiddel (såsom ethidiumbromid eller propidiumiodid). Denne teknik, som er dyr med hensyn til både udstyr og materialer, adskiller det supersnoede (plasmid) DNA fra lineært kromosomalt og hakket cirkulært DNA i henhold til flydende tæthed, hvilket muliggør indsamling af højrent plasmid DNA. For nylig har forenklede ionbytningssøjlekromatografimetoder (almindeligvis betegnet en mini-forberedelse) har stort set fortrængt den besværlige og tidskrævende centrifugeringsprotokol for at give store mængder af endotoksinfrit plasmid-DNA på relativt kort tid.

Specialiserede bakterielle mutanter, kaldet kompetent celler, er blevet udviklet til bekvem og relativt billig amplifikation af plasmidvektorer. Bakterierne indeholder en palet af mutationer, der gør dem særligt modtagelige for plasmidreplikation, og er blevet kemisk permeabiliseret til overførsel af DNA'et over membranen og cellevæggen i en procedure kendt som transformation. Efter transformation dyrkes bakterierne til logaritmisk fase i nærvær af selektionsantibiotikumet dikteret af plasmidet. Bakteriekulturen koncentreres ved centrifugering og afbrydes ved lysis med en alkalisk detergentopløsning indeholdende enzymer for at nedbryde kontaminerende RNA. Lysatet filtreres derefter og anbringes på ionbyttersøjlen. Uønskede materialer, herunder RNA, DNA og proteiner, vaskes grundigt fra søjlen, før plasmid-DNA'et elueres ved hjælp af en buffer med højt saltindhold. Alkohol (isopropanol) præcipitation koncentrerer det eluerede plasmid DNA, som opsamles ved centrifugering, vaskes og genopløses i buffer. Det oprensede plasmid-DNA er klar til brug i transfektionseksperimenter.

Figur 8 - Lipid-medieret transfektion i pattedyrceller

Pattedyrceller, der anvendes til transfektion, skal være i fremragende fysiologisk tilstand og vokse i logaritmisk fase under proceduren. Et bredt spektrum af transfektionsreagenser er blevet kommercielt udviklet for at optimere optagelsen af ​​plasmid-DNA af dyrkede celler. Disse teknikker spænder fra simpel calciumphosphatfældning til sekvestrering af plasmid-DNA'et i lipidvesikler, der fusionerer til cellemembranen og leverer indholdet til cytoplasmaet (som illustreret i Figur 8). Samlet betegnet lipofektion, har den lipid-baserede teknologi mødt udbredt accept på grund af dens effektivitet i et stort antal populære cellelinjer, og det er nu den foretrukne metode til de fleste transfektionseksperimenter.

Selvom forbigående transfektioner sædvanligvis resulterer i tab af plasmidgenprodukt over en relativt kort periode (adskillige dage), fortsætter stabilt transficerede cellelinjer med at producere gæsteproteinerne på en kontinuerlig langtidsbasis (fra måneder til år). Stabile cellelinjer kan udvælges ved hjælp af antibiotiske markører til stede i plasmidrygraden (se Figur 7). Et af de mest populære antibiotika til udvælgelse af stabile transfektanter i pattedyrscellelinjer er det proteinsyntesehæmmende lægemiddel G418, men den nødvendige dosis varierer meget afhængigt af hver cellelinje. Andre almindelige antibiotika, bl.a hydromycin-B og puromycin, er også blevet udviklet til stabil celleselektion, ligesom genetiske markører. Den mest effektive metode til at opnå stabile cellelinjer er at anvende en højeffektiv teknik til den indledende transfektion. I denne forbindelse elektroporation har vist sig at generere stabile transfektanter med lineariserede plasmider og oprensede gener. Elektroporation påfører korte højspændingsimpulser til en cellulær suspension for at inducere poredannelse i plasmamembranen, hvilket efterfølgende tillader transfektions-DNA'et at trænge ind i cellen. Specialudstyr er nødvendigt til elektroporation, men teknikken kan sammenlignes med lipofektionsreagenser, når der udføres et stort antal transfektioner.

Fremtiden for fluorescerende proteiner

Fokus for den nuværende udvikling af fluorescerende protein er centreret om to grundlæggende mål. Den første er at perfektionere og finjustere den nuværende palet af blå til gule fluorescerende proteiner afledt af Aequorea victoria vandmænd, mens det andet mål er at udvikle monomere fluorescerende proteiner, der udsender i de orange til langt røde områder af det synlige lysspektrum. Fremskridtet hen imod disse mål har været ret imponerende, og det er ikke utænkeligt, at nær-infrarøde fluorescerende proteiner tårner sig op i horisonten.

Den seneste generation af vandmandsvarianter har løst de fleste af manglerne ved den første generations fluorescerende proteiner, især for de gule og grønne derivater. Søgningen efter et monomert, lyst og hurtigt modnende rødt fluorescerende protein har resulteret i flere nye og interessante klasser af fluorescerende proteiner, især dem, der stammer fra koralarter. Udvikling af eksisterende fluorescerende proteiner vil sammen med nye teknologier, såsom indsættelse af unaturlige aminosyrer, udvide farvepaletten yderligere. Efterhånden som teknikker til optisk spektral separation bliver bedre udviklet og mere udbredt, vil disse nye varianter supplere den eksisterende palet, især i de gule og røde områder af spektret.

Den nuværende tendens inden for fluorescerende probeteknologi er at udvide rollen af ​​farvestoffer, der fluorescerer til det fjerne røde og nær infrarøde. I pattedyrsceller er både autofluorescens og absorption af lys kraftigt reduceret i den røde ende af spektret. Udviklingen af ​​langt røde fluorescerende prober ville således være yderst nyttig til undersøgelse af tykke prøver og hele dyr. I betragtning af fluorescerende proteiners succes som reportere i transgene systemer, vil brugen af ​​langt røde fluorescerende proteiner i hele organismer blive stadig vigtigere i de kommende år.

Endelig er det enorme potentiale i fluorescerende proteinapplikationer til konstruktion af biosensorer lige nu ved at blive realiseret. Antallet af biosensorkonstruktioner vokser hurtigt. Ved at bruge strukturel information har udviklingen af ​​disse sonder ført til forbedret følsomhed og vil fortsætte med at gøre det. Succesen med disse bestræbelser tyder bestemt på, at næsten enhver biologisk parameter vil være målbar ved hjælp af den passende fluorescerende proteinbaserede biosensor.

Medvirkende forfattere

David W. Piston - Institut for Molekylær Fysiologi og Biofysik, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, 37232.

George H. Patterson og Jennifer Lippincott-Schwartz - Cellebiologi og metabolisme afdeling, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

Nathan S. Claxton og Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Relaterede Nikon-produkter

Fluorescerende filterterninger

Nikon tilbyder en bred vifte af fluorescensfilterterninger med høj fluorescensoptagelseseffektivitet for at understøtte billeddannelse af en lang række fluoroforer og fluorescerende proteiner.

Lyskilder

Nikon tilbyder lyskilder til en bred vifte af billedbehandlingsbehov, fra koaksiale systemer til stereomikroskopi til LED-baserede illuminatorer til epifluorescensapplikationer og kraftfulde laserenheder til avancerede billedbehandlingsapplikationer. Mange af vores lysløsninger inkluderer unikke implementeringer og kan udløses til højhastighedskontrol.


ORIGINELLE FORSKNINGSPAPIRER

Coons, A. H., Creech, H. J. & Jones, R. N. Immunologiske egenskaber af et antistof, der indeholder en fluorescerende gruppe. Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 47, 200–202 (1941)

Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. & Berliner, E. Demonstration af pneumokok-antigen i væv ved brug af fluorescerende antistof. J. Immunol. 45, 159–170 (1942)

YDERLIGERE LÆSNING

Coons, A. H. & Kaplan, M. H. Lokalisering af antigen i vævsceller: forbedringer i en metode til påvisning af antigen ved hjælp af fluorescerende antistof. J. Exp. Med. 91, 1–13 (1950)

Coons, A. H. Begyndelsen af ​​immunfluorescens. J. Immunol. 87, 499–503 (1961)


Vidensbaseret design af reagensløse fluorescerende biosensorer fra rekombinante antistoffer

Muligheden for at opnå et fluorescerende konjugat fra et hvilket som helst antistof, som reagerer på bindingen af ​​antigenet ved en variation af dets fluorescens, ville være af stor interesse i de analytiske videnskaber og for konstruktionen af ​​proteinchips. Denne mulighed blev undersøgt med antistof mAbD1.3 rettet mod hønseæggehvidelysozym. Regler for design blev udviklet for at identificere resterne af antistoffet, som en fluorofor kunne kobles kemisk til, efter at have ændret dem til cystein ved mutagenese. Disse regler var baseret på: målresten, der tilhører et topologisk kvarter af antigenet i strukturen af ​​komplekset mellem antistof og antigen, dets fravær af funktionel betydning for interaktionen med antigenet og dets opløsningsmiddeltilgængelighed i strukturen af ​​det frie antistof. Sytten konjugater mellem det enkeltkædede variable fragment scFv af mAbD1.3 og en miljøfølsom fluorofor blev konstrueret. For seks af de ti rester, som fuldt ud opfyldte designreglerne, var den relative variation af fluorescensintensiteten mellem de frie og bundne tilstande af konjugatet omfattet mellem 12 og 75 % (i ikke-optimal buffer) og konjugatets affinitet for lysozym forblev uændret i forhold til det parentale scFv. I modsætning hertil var sådanne resultater kun sande for én af de syv rester, som ikke opfyldte en af ​​reglerne og blev brugt som kontroller. Et af konjugaterne blev undersøgt mere detaljeret. Dets fluorescens steg proportionalt med koncentrationen af ​​lysozym i et nanomolært område, op til 90% i en defineret buffer og 40% i serum. Denne stigning var specifik for hønseæg-lysozym, og den blev ikke observeret med et nært beslægtet protein, kalkunæg-lysozym. De rester, der gav operationelle konjugater (seks i VL og en i VH), var lokaliseret i umiddelbar nærhed af rester, som er funktionelt vigtige, langs sekvensen af ​​FvD1.3. Resultaterne foreslår designregler for konstruktion af antigenfølsomme fluorescerende konjugater fra et hvilket som helst antistof i fravær af strukturelle data.